猪繁殖与呼吸综合征是动物二类传染病,俗称蓝耳病,可通过个体接触、污染物和空气传播。PRRS现已成为规模化养猪场的主要疫病之一,给世界养猪产业造成了重大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒颗粒呈椭球体,由囊膜包裹,直径在50⁷4 nm之间。根据病毒基因序列和抗原性等方面的差异,又将其分为基因Ⅰ型和基因Ⅱ型。PRRSV因其抑制先天性免疫应答的能力,目前仍然是严重危胁养猪业安全的病原之一。研究表明,获得性免疫应答反应在PRRSV感染的机体内起着关键性的免疫保护作用,而PRRSV GP2蛋白不仅是病毒侵染宿主细胞的必要结构蛋白,还能引起宿主产生明显的获得性免疫应答。本研究通过合成GP2蛋白的重叠多肽,采用间接ELISA和IFN-γELISPOT的方法筛选并得到了GP2蛋白3个B细胞表位和6个T细胞表位,为新型表位疫苗的研究提供帮助。将实验室保存的PRRSV JXA1-R毒株进行扩增,根据Reed-Muench两氏法测定其病毒滴度为10⁶.6.6 TCID₅₀/mL。提取JXA1-R毒株总RNA并逆转录成cDNA,以cDNA为模板扩增得到了ORF2基因序列全长,并成功构建了pMD19-T-ORF2克隆载体。根据ORF2目的基因测序结果推导出JXA1-R毒株GP2蛋白氨基酸序列。以pMD19-T-ORF2为模板,PCR扩增GP2蛋白胞外区基因序列,与pET-32a表达载体连接后转化到Rosetta（DE3）表达菌中构建GP2蛋白重组表达菌pET-32a-GP2-Rosetta（DE3）。GP2重组蛋白以包涵体形式表达,分子量约为36kDa。经Western Blot鉴定,GP2重组蛋白具有良好的反应原性。以收集得到的PRRSV JXA1-R病毒液作为免疫原,采用肌肉注射的方法对试验组5头PRRSV抗体阴性试验猪进行两次免疫,免疫间隔时间为两周,免疫剂量为3×10⁶ TCID₅₀。以细胞破碎后上清液为免疫原,免疫对照组3头试验猪,采用相同的免疫方式进行免疫。免疫后每周对试验猪采血,分离血清样品。免疫12周后,大量采血分离外周血单核细胞。经PRRSV抗体检测试纸检测,试验组动物首次免疫3周后血清中就能检测到PRRSV特异性抗体。通过间接ELISA测定,试验组5头猪在首次免疫后第4周开始出现GP2蛋白抗体,第8⁹周抗体水平达到顶峰并趋于平稳。将GP2蛋白氨基酸序列按照重叠多肽法设计并成功合成了22条长度为18个氨基酸残基的重叠多肽段,相邻肽段重叠9个氨基酸。以合成的GP2蛋白重叠多肽为包被原,首次免疫12周后分离得到的猪阳性血清为一抗,采用间接ELISA的方法检测血清中抗体与重叠多肽的反应性,从而对GP2蛋白B细胞表位进行筛选。最终筛选得到GP2蛋白3个免疫显性的B细胞表位,分别是77⁹4aa、113¹30 aa、131¹48 aa,氨基酸序列比对结果显示筛选到的3个B细胞表位在北美洲型毒株间的同源性达到92%以上。将分离得到的猪外周血单核细胞进行体外培养,并用重叠多肽进行刺激,采用ELISPOT方法检测猪外周血单核细胞所分泌的IFN-γ,记录不同试验组所呈现的斑点数,若斑点数大于等于阳性判定临界值,则判定该多肽为阳性多肽。经肽库和单肽两轮筛选,最终筛选出GP2蛋白6个T细胞表位,分别是86¹03 aa、95¹12 aa、104¹21 aa、113¹30aa、140¹57 aa和185²02 aa。