周围神经损伤的治疗，尤其是神经缺损的治疗，是尚未解决的世界性难题。虽然应用自体神经移植来修复神经缺损是目前临床上最为可靠的修复方法，但是自体神经移植本生所带来的并发症往往限制了这种方法的临床应用。因此，利用组织工程学原理构建人工神经来替代自体神经修复神经缺损是目前的研究趋势。然而，由于神经支架体积较大或支架血管化较慢的原因，植入体内后早期神经支架内部往往处于缺氧环境下。大量研究表明：缺氧是影响迁移入神经支架内雪旺细胞存活和再生神经功能的重要因素。而且，低氧环境可以显著降低植入支架内种子细胞的存活率，从而在很大程度上限制了其修复神经缺损效能的发挥。因此，提高神经支架内部氧分压，尤其是在移植入早期，可明显改善神经再生微环境，提高种子细胞的存活率，并促进神经的有效再生。目前，有关改善神经支架内低氧环境的研究主要集中于神经支架血管化和高压氧治疗。然而，神经支架的血管化需要较长的时间，而高压氧治疗又存在着种种缺陷，诸如较低的局部氧供改善效率、高昂的治疗费用、高压氧舱封闭条件带来不利影响等。因此，寻找一种更迅速、更方便、更有效和更安全的神经支架氧供解决方案，规避上述缺点，对于更好的实现人工神经修复周围神经损伤具有重要的临床意义。本研究在制备胶原-壳聚糖神经导管和全氟三丁胺（Perfluorotributylamine, PFTBA）水凝胶的基础上，在体外或体内将神经导管、PFTBA水凝胶与嗅鞘细胞（种子细胞）有机结合，用于周围神经缺损的相关研究，以研究PFTBA水凝胶促进周围神经再生的效能及相关机制。整个研究分为以下四个部分：实验一：胶原-壳聚糖神经导管的制备及相关理化性质和生物学性能检测背景：在众多神经组织工程支架材料中，神经导管修复神经缺损的效果是经多项动物或临床研究证实的。而且，已经有部分神经导管经过FDA认证，并应用于临床桥接患者神经缺损。然而，大多数神经导管的管壁为密封式设计且不可降解，这样虽然可以使导管具有良好的机械强度和有效限制疤痕组织长入的能力，但是同时也不利于营养物质、氧和代谢产物的运输，且需要二次手术取出残留的植入结构。因此，制备出具有良好生物学性能的多微孔可降解的神经导管，有望改善神经导管修复神经缺损的效果。目的：构建可降解的胶原-壳聚糖神经导管，并检测其理化性质和生物学性能。方法：以胶原和壳聚糖为原料，利用改良的配方和溶质配比方案制备出具有不同理化性质的胶原-壳聚糖神经导管，并通过扫描电镜检测等方法，对各神经导管的性能进行纵向对比研究，筛选出具有良好理化性质的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管，用于本实验的体内研究，验证其生物学性能。结果：随着配比方案中胶原成分从0%-100%的增加，神经导管的微孔直径呈进行性下降的趋势。其中，胶原：壳聚糖（4：1）神经导管的孔隙率为92.72±1.83%，且体外降解速度适中，符合组织工程神经支架的构建要求。将该神经导管（胶原：壳聚糖=4：1）植入体内后，发现其具有较好的组织相容性，植入体内后仍保持较好的大体形态和防止管外细胞成分长入的能力，且该神经导管具有促进并引导神经再生的潜力。结论：胶原：壳聚糖（4：1）神经导管具有良好的理化和生物学性质，具有促进并引导神经再生的潜力。实验二：PFTBA水凝胶复合神经导管修复大鼠12mm坐骨神经缺损的有效性及机制研究背景：目前，应用组织工程神经导管来修复周围神经缺损是该类损伤的治疗趋势。然而，植入体内后早期神经导管内部的低氧环境很大程度上限制了其修复神经缺损效能的发挥。因此，提高早期神经导管内部氧分压，有望明显改善神经再生微环境，并促进神经的有效再生。以往研究表明：高压氧可提高神经损伤局部的氧分压，并明显促进神经的再生。但是，这种方法存在着局部氧供改善效率低等诸多缺点。因此，将含有增氧剂PFTBA的水凝胶与神经导管直接复合，可能是一种更迅速、更方便、更有效和更安全的神经支架氧供解决方案，有望明显改善支架内部早期的缺氧环境，并促进神经再生和功能恢复。目的：探讨PFTBA水凝胶复合神经导管后，促进神经再生的效能和机制。方法：应用复合PFTBA水凝胶的神经导管修复SD大鼠12mm坐骨神经缺损，通过对不同时间点和不同部位的再生神经的形态计量学分析、免疫组化染色和荧光金逆行示踪评估术后神经再生情况；通过对大鼠术侧下肢的神经电生理、行为学评估以及靶位肌肉的形态学染色，来评估术后神经功能恢复情况；通过对再生神经的微血管计数以及BDNF、NGF、VEGF和S-100的RT-PCR检测和Western Blot检测，来分析PFTBA水凝胶促进神经再生的机制。结果：虽然自体神经的修复效果仍然最好，但是复合PFTBA水凝胶的神经导管与没有复合PFTBA水凝胶的神经导管相比，可以更加有效的促进周围神经的再生和神经功能的恢复。此外，PFTBA明显的提高了再生神经内部BDNF、NGF和S-100的转录与表达。因此，PFTBA可以有效的促进迁移入导管内雪旺细胞的存活以及功能的发挥，从而促进神经的有效再生。结论：PFTBA水凝胶可以明显改善神经导管内部早期的缺氧环境，促进宿主雪旺细胞的存活以及功能的发挥，从而促进周围神经的再生和功能恢复。实验三：PFTBA在嗅鞘细胞缺氧模型中保护作用的研究背景：随着神经组织工程的发展，研究者们发现：接种种子细胞是赋予神经支架活性最有效的方法。其中，大量研究已经证实：嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）作为一种具有雪旺细胞和星形胶质细胞特性的大胶质细胞，在周围神经损伤的治疗中可发挥重要的修复作用。然而，移植后早期支架内部的低氧环境不利于嗅鞘细胞的存活和功能状态的发挥，以至于降低应有的修复效果。因此，研究嗅鞘细胞对缺氧的耐受能力以及改善缺氧环境的有效方法成为了目前一个亟需解决的问题。目的：探讨PFTBA对体外嗅鞘细胞缺氧模型的保护作用。方法：将分离纯化后的嗅鞘细胞分为4组：正常培养组（A组）、正常培养+PFTBA组（B组）、缺氧培养组（C组）和缺氧培养+PFTBA组（D组），继续培养12h和24h。其中，B组和D组，按照PFTBA的浓度不同，B组分为正常培养+5%PFTBA组（B1组）和正常培养+10%PFTBA组（B2组），而D组分为缺氧培养+5%PFTBA组（D1组）和缺氧培养+10%PFTBA组（D2组）。随后，应用流式细胞技术检测各组嗅鞘细胞的凋亡比率；应用扫描电镜检测各组嗅鞘细胞的形态学变化；应用DAPI染色和MTT检测各组嗅鞘细胞的活性；应用RT-PCR、Western Blot和ELISA检测各组嗅鞘细胞NGF和BDNF表达、合成和分泌的情况。结果：缺氧12h后，嗅鞘细胞即开始出现凋亡现象，而且随着时间的延长，凋亡的细胞数目激增，同时存活细胞的活性也明显下降，合成、分泌BDNF和NGF的能力也明显降低；而应用10%PFTBA与嗅鞘细胞在缺氧环境下共培养，可以显著的降低凋亡细胞的比例，提高存活细胞的活性，并在一定程度上维持细胞合成和分泌BDNF、和NGF的能力。结论：含有10%PFTBA的培养液可以有效的抵抗体外的低氧环境，促进嗅鞘细胞的存活和功能状态的发挥。实验四：PFTBA-嗅鞘细胞水凝胶复合神经导管修复大鼠15mm坐骨神经缺损的有效性以及机制研究背景：将种子细胞和神经支架相复合，构建功能性细胞神经支架是目前神经组织工程发展的趋势。然而，由于支架本身体积较大和支架血管化程度较慢的原因，移植早期神经支架内部的氧分压难以维持种子细胞的存活，从而导致细胞的死亡，以至于修复效果大打折扣。因此，如何才能够保证接种到神经支架中的种子细胞，既能够大量、均匀的分布，又能够保持良好的活性和功能状态，成为了目前一个亟需解决的问题。目的：研究PFTBA-嗅鞘细胞水凝胶复合神经导管后，促进神经再生的效能和机制。方法：将绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）标记的嗅鞘细胞和PFTBA混合入水凝胶，并充填入神经导管内，用于修复SD大鼠15mm坐骨神经缺损。通过对再生神经的形态计量学分析和荧光金逆行示踪评估术后神经再生情况；通过对大鼠术侧下肢的神经电生理、行为学评估以及靶位肌肉的形态染色，来评估术后神经功能恢复情况；通过对再生神经的微血管计数、GFP阳性细胞计数以及BDNF、NGF、VEGF和S-100的RT-PCR检测，来分析PFTBA水凝胶促进嗅鞘细胞存活和神经再生的机制。结果：虽然自体神经的修复效果仍然最好，但是复合PFTBA的细胞支架与没有复合PFTBA的细胞支架相比，可以更加有效的促进周围神经的再生和神经功能的恢复，且复合PFTBA可以明显缓解细胞支架内表达GFP嗅鞘细胞数目的下降趋势，提高了再生神经内部BDNF、NGF和S-100的mRNA的水平。因此，PFTBA可以有效的促进移植入导管内嗅鞘细胞的存活，使其生物学功能得到充分发挥，从而为神经再生提供适宜的微环境，促进神经的有效生长。结论：PFTBA水凝胶可以明显改善神经导管内部早期的缺氧环境，促进移植入导管内嗅鞘细胞的存活以及功能的发挥，从而更好的促进周围神经的再生和功能恢复。