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TNF-α是一个具有广泛生物学功能的细胞因子,以两种生物活性形式存在,即26kD的跨膜型(transmembrane TNF-α, tmTNF-α)和17kD的分泌型(secreted TNF-α, sTNF-α),后者由TNF-α转化酶(TNF alpha-converting enzyme TACE)酶切tmTNF-α胞外段而形成。两型TNF-α的分子结构,受体亲和力以及作用方式均不同,因此,二者的功能不尽相同。目前,关于sTNF-α的生物学功能有大量报道,而tmTNF-α的生物学功能却报道较少。tmTNF-α不但可与受体结合,通过正向信号对靶细胞发挥生物学效应,而且tmTNF-α本身也可作为受体,通过反向信号对tmTNF-α表达细胞发挥效应。近年来,肿瘤微环境内源性TNF-α作为一种关键性炎症因子参与肿瘤的发生发展引起广泛关注。乳腺癌患者血浆tmTNF-α升高,且常预后差。在HER2转基因小鼠中阻断tmTNF-α可抑制肿瘤生长。本课题组前期研究证实90%以上的导管浸润性乳腺癌表达tmTNF-α,且转染tmTNF-α信号肽(LS)使sTNF-α敏感的MCF-7乳腺癌细胞转变为耐受株,提示tmTNF-α可能通过其反向信号导致肿瘤细胞抵抗凋亡。那么,tmTNF-α是否也能通过其反向信号诱导乳腺癌细胞抵抗化疗呢?如是,其机制如何?关于这些问题至今尚未见到相关报道。本研究通过体外实验证实tmTNF-α与阿霉素耐药间关系,并阐明其分子机制。通过在体干扰TNF-α表达,进一步验证tmTNF-α在乳腺癌中的病理作用及诱导肿瘤耐药的作用；为提高乳腺癌化疗和敏感性提供实验依据,为乳腺癌和其它肿瘤的治疗提供新的思路和靶点。第一部分tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素抵抗及其机制的体外研究1.高表达tmTNF-α乳腺癌细胞对阿霉素耐药：用流式检测证实MCF-7几乎不表达tmTNF-α,而MDA-MB-231则高表达tmTNF-α(76%)。给予不同浓度的阿霉素处理48小时,MTT与DNA片段化结果显示不表达tmTNF-α的MCF-7细胞对阿霉素敏感,而高表达tmTNF-α的MDA-MB-231细胞则对阿霉素诱导的凋亡发生抵抗。提示：tmTNF-α可能与乳腺癌细胞对阿霉素抵抗相关。2.抑制TNF-α表达增强MDA-MB-231对阿霉素的敏感性：稳定转染TNF-αshRNA可使MDA-MB-231 tmTNF-α的表达率从76.3%下降到21.5%,并明显增加其对阿霉素诱导凋亡的敏感性。提示TNF-α可能导致MDA-MB-231对阿霉素的耐药。3.过表达TNF-LS降低MCF-7细胞对阿霉素的敏感性：为排除正向信号以及sTNF-α的影响,我们稳转tmTNF-α信号肽(leader sequence, LS)于不表达TNF-α的MCF-7细胞,结果使该细胞由阿霉素的敏感株变为耐药株。提示tmTNF-α通过反向信号诱导对ADM的耐药。4. tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药与MDR1、BCRP和MRP1表达无关：ABC类家族的药物转运蛋白分子是导致ADM耐药最常见的原因之一。我们采用Real-time PCR发现过表达TNF-LS或干扰tmTNF-α的表达,对两株乳腺癌细胞耐药基因MDR1、BCRP和MRP1的mRNA水平无影响；同样,阿霉素处理也未见明显改变(p>0.05)。我们应用FCM证实MDR1的蛋白水平与其转录水平一样,未见明显改变。上述结果提示tmTNF-α介导的乳腺癌细胞阿霉素耐药可能与上述耐药基因的表达无关。5. tmTNF-α不影响乳腺癌细胞表达HER2:因为HER2过表达是促进乳腺癌细胞增殖和化疗抵抗的重要分子,我们应用FCM证实：转染TNF-LS对MCF-7表达HER2无影响,且阿霉素处理后无明显改变,提示HER2表达可能不受tmTNF-α的影响。6. ERK信号通路参与tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药：ERK1/2是常见的促生存而导致化疗耐药的信号途径之一。用WB方法证实MCF-7转染TNF-LS可促进ERK1/2组成性磷酸化。下调tmTNF-α后可抑制MDA-MB-231 ERK1/2组成性磷酸化；用ERK1/2抑制剂PD8059可拮抗tmTNF-α反向信号的作用,逆转MCF-7/TNF-LS和MDA-MB-231对阿霉素的敏感性。提示ERK1/2信号通路参与tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药。7. NF-κB信号通路参与tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药：NF-κB也是导致肿瘤细胞耐药的重要途径之一。用ELISA和WB证实：转染TNF-LS可促进MCF-7的IκB降解和NF-κB组成性活化。下调tmTNF-α可抑制MDA-MB-231的I B降解和NF-κB组成性活化。NF-κB特异性抑制剂BAY118072可拮抗tmTNF-α反向信号的作用,逆转MCF-7/TNF-LS和MDA-MB-231对阿霉素的敏感性。提示NF-κB信号通路参与tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药。8.抗凋亡基因IAP家族与BCL2家族基因参与tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素耐药：我们应用Real-time PCR与Western blot证实：MCF-7/TNF-LS和MDA-MB-231抗凋亡分子BCL-xl、cIAP1、xIAP组成性表达增加,而促凋亡分子BAX基因转录则减少。提示tmTNF-α可能通过NF-κB促进抗凋亡分子表达,并阻断阿霉素诱导的促凋亡分子BAX基因转录,从而抵抗阿霉素耐药。第二部分tmTNF-α介导乳腺癌阿霉素抵抗的体内研究1.干扰tmTNF-α表达对MDA-MB-231体内成瘤率影响：我们将高表达tmTNF-α的MDA-MB-231亲本细胞与稳转TNF-αshRNA的MDA-MB-231接种于裸鼠,结果显示：亲本细胞100%成瘤率需10天,干扰tmTNF-α(干扰率约为80%)100%成瘤率需20天,提示干扰TNF-α基因表达后,MDA-MB-231的成瘤时间明显延长。2.干扰tmTNF-α表达联合阿霉素处理抑制裸鼠移植瘤的生长：我们利用上述动物模型,待移植瘤长至约100mm3时,开始用4mg/kg阿霉素腹腔注射干预3周。结果显示：单独TNF-α干扰组的肿瘤体积明显比对照组小(p=0.0007),肿瘤抑制率约为26%,提示干扰TNF-α表达即可抑制MDA-MB-231移植瘤的生长。当联合阿霉素处理时,其肿瘤体积变小更加明显,其抑瘤率为61%,提示干预tmTNF-α表达可以显著提高体内阿霉素的治疗效果。3.干扰tmTNF-α表达联合阿霉素处理促进裸鼠移植瘤的凋亡：阿霉素主要通过诱导细胞凋亡来发挥抗瘤作用。我们应用Caspase 3酶活性检测细胞凋亡,证实：单独干扰tmTNF-α表达对Caspase 3酶活性无影响,当与阿霉素联合处理时,Caspase 3酶活性明显增加(p=0.0343)。提示干扰tmTNF-α表达可促进阿霉素诱导的细胞凋亡,从而提高化疗作用。4.干扰tmTNF-α表达联合阿霉素处理对裸鼠生存时间的影响：我们用干扰tmTNF-α表达联合阿霉素处理,对荷瘤裸鼠生存时间进行观察。结果显示：高表达tmTNF-α的乳腺癌荷瘤动物生存时间最短,其中位生存期为31天,稳转TNF-αshRNA组则为41.5天,而联合阿霉素处理后其中位生存期为60.5天,生存时间明显延长(p=0.0002),提示干扰tmTNF-α表达联合阿霉素处理可以明显延长荷瘤裸鼠的生存时间。综上所述,TNF-α可通过其反向信号诱导乳腺癌细胞对阿霉素药耐药,其主要机制是通过组成性激活促生存途径ERK1/2和NF-κB通路,促进抗凋亡分子cIAP1、xIAP和BCL-xl表达,从而抵抗阿霉素诱导的凋亡。在体研究证实：干预TNF-α表达可以减缓肿瘤生长,并对阿霉素诱导的凋亡具有增敏作用,提示TNF-α是乳腺癌治疗的潜在靶点,为临床乳腺癌个体化治疗提供了新的思路。