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目的：1、针对胰腺癌发生发展过程中存在的多种抑癌基因甲基化失活,癌基因异常活化的现状,使用5-azacytidine这种去甲基化药物干预后,观察5-azacytidine能否对异常甲基化的抑癌基因p16Ink4a及促癌信号通路Wnt/β-catenin信号通路的影响。2、针对上一步得到的结果及p16Ink4a在胰腺癌中低表达而Wnt/β-catenin信号通路异常激活的状态,观察促进β16Ink4a在胰腺癌中表达增加是否会影响Wnt/β-catenin信号通路的活性。方法：选取人胰腺癌细胞株Bxpc-3及Miapaca-2细胞并培养,用不同浓度5-azacytidine (Oμmol/L、5μmol/L、10μmol/L分别处理24h、48h、72h后,测定P16Ink4amRNA及Wnt信号通路关键信号分子β-catenin、c-myc、cyclinD1mRNA表达,提取细胞总蛋白,Western blotting方法测定β-catenin、c-myc、 cyclinD1蛋白的表达量；以CCK8细胞毒性试剂盒测定5-azacytidine对Bxpc-3细胞增殖能力的影响；流式细胞仪测定5-azacytidine对胰腺癌细胞Bxpc-3早期凋亡的影响。2、以人胰腺癌细胞系Bxpc-3及Miapaca-2细胞株为研究对象,以pcDNA3.0质粒为载体,将含有p16Ink4a基因的pcDNA3.0的质粒转染Bxpc-3细胞及Miapaca-2细胞,转染成功后测定Wnt信号通路关键信号分子P16Ink4a、β-catenin、c-myc、cyclinD1mRNA及蛋白的表达,以CCK8细胞毒性试剂盒测定对Bxpc-3细胞增殖能力的影响,以流式细胞仪检测其对细胞周期的影响。结果：1、在含有不同药物浓度的5-azacytidine细胞培养基中,Bxpc-3细胞的增殖受到明显抑制,实时荧光定量PCR发现在同一时点随着药物浓度的增加或同一浓度随着作用时间的延长,p16Ink4a mRNA表达增加、Wnt信号通路关键信号分子β-catenin, c-myc、cyclinD1mRNA及蛋白水平的表达也受到显著抑制,5-azacytidine可通过增加p16Ink4a的表达增加对人胰腺癌细胞Bxpc-3胞内关键信号分子β-catenin起到显著抑制作用,进而抑制Wnt信号通路活性、其靶基因c-myc、 cyclinD1的表达亦受到抑制。流式细胞仪检测发现随着药物作用时间的延长及药物浓度的增加,Bxpc-3中瘤细胞早期凋亡明显增加,而晚期凋亡细胞未见明显增加。2、以pcDNA3.0质粒为载体,将含有p16Ink4a的质粒转染进入Bxpc-3及Miapaca-2两株人胰腺癌细胞,转染成功后,p16Ink4a基因mRAN表达水平明显增加,这一现象在后面的p16蛋白的Western blotting检测中得到证实,同时在本次实验中还检测了Wnt信号通路关键信号分子β-catenin, c-myc、cyclinD1mRNA及蛋白水平,实验发现：转染p16Ink4a后Bxpc-3及Miapaca-2两株细胞中β-catenin的蛋白表达明显受到抑制,而在Bxpc-3中c-myc同时也受到明显抑制,但是cyclinD1mRNA水平、蛋白质的表达未见明显抑制,在Miapaca-2细胞中,c-myc及cyclinD1mRNA及蛋白质表达未受到显著抑制。结论：5-azacytidine可通过其去甲基化作用使得胰腺癌细胞中原先低表达的p16Ink4a基因的重新表达增加,同时对胰腺癌细胞的增殖能力起到抑制作用,增加胰腺癌细胞早期凋亡；对β-catenin、c-myc及cyclinD1的表达起到抑制作用,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性起到显著的抑制作用。但5-azacytidine的去甲基化作用缺乏选择性,Wnt/β-catenin信号通路的活性抑制可能同时受到包括Wnt信号通路抑制因子的激活等多种信号通路的多重调控；对胰腺癌细胞瞬时转染p16Ink4a基因后,胰腺癌细胞中p16Ink4a的表达增强可影响Wnt/β-catenin信号通路的活性,但对c-myc及cyclinD1两种Wnt/β-catenin信号通路的靶基因影响作用不明显,其具体分子机制值得进一步研究。