【摘 要】
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柑橘是世界第一大水果,具有较大的经济价值和营养价值,但是柑橘黄龙病的出现对柑橘产业造成了毁灭性的打击,目前仍没有有效的治疗手段。本研究利用生防菌的生物防治作用,探究了3种菌剂对黄龙病的防治效果,以及对植株根系形态特征的影响。其中重点研究了4号菌剂的分离与鉴定,确定了其分类地位,防治效果,以及菌剂处理对植株一些生理生化指标的影响,并利用实时荧光定量PCR对7种抗性相关基因的表达量进行了分析,具体研究
【基金项目】
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国家重点研究开发计划(2018YFD0201500); 中国国家自然科学基金(编号31872064和31572099);
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柑橘是世界第一大水果,具有较大的经济价值和营养价值,但是柑橘黄龙病的出现对柑橘产业造成了毁灭性的打击,目前仍没有有效的治疗手段。本研究利用生防菌的生物防治作用,探究了3种菌剂对黄龙病的防治效果,以及对植株根系形态特征的影响。其中重点研究了4号菌剂的分离与鉴定,确定了其分类地位,防治效果,以及菌剂处理对植株一些生理生化指标的影响,并利用实时荧光定量PCR对7种抗性相关基因的表达量进行了分析,具体研究结果如下:1、4号菌剂的分离鉴定。将菌剂涂布培养,分离优势菌株,纯化后得到4号菌剂单菌落,菌落特征为圆形,乳白色,边缘整齐,表面光滑。革兰氏染色后,经显微镜观察得知其染色结果为阳性,杆状,有芽孢,聚合呈链状。经扫描电镜观察,发现该菌株大小为0.6 μm×(1.3~2.0)μm,有二分裂状态。明胶液化试验,丙二酸试验,柠檬酸盐试验,葡萄糖氧化发酵试验,淀粉水解试验结果均为阳性,甲基化试验和V-P试验结果均为阴性。通过对4号菌剂的16SrDNA及recA基因序列进行扩增,测序,序列比对和系统发育树构建,发现其和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)同源性高达93%,最终推测其为贝莱斯芽孢杆菌。2、菌剂处理前后植株黄龙病病原检测情况。‘砂糖橘’和‘沃柑’植株选取叶片进行检测,‘南丰蜜橘’植株选取叶片和枝皮进行检测。综合实时荧光定量PCR和常规PCR检测结果来看(其中一种方法检测为阳性,即判定为阳性植株),处理前苗木为阳性植株。通过详细的菌剂处理试验,‘砂糖橘’和‘沃柑’植株在菌剂灌根处理21次后,选取叶片进行黄龙病病原检测,其中A菌剂处理的‘砂糖橘’植株阴性率提高了 75%。4号菌剂处理的‘砂糖橘’植株阴性率提高了 25%,‘沃柑’植株阴性率提高了 50%。对照组‘砂糖橘’植株阴性率不变,‘沃柑’植株阴性率由50%下降至0%。试验结果说明A菌剂,4号菌剂处理能使‘砂糖橘’和‘沃柑’植株阴性率得到提高,能够抑制植株体内病原的增殖。‘南丰蜜橘’植株在菌剂灌根处理14次后,选取叶片和枝皮进行黄龙病病原检测,其中4号菌剂处理的‘南丰蜜橘’植株阴性率提高了11.54%,2号菌剂处理的‘南丰蜜橘’植株阴性率提高了 16.67%,对照组的‘南丰蜜橘’植株阴性率仍为0%。结果表明4号菌剂和2号菌剂能够提高‘南丰蜜橘’植株阴性率,可以降低植株体内黄龙病病原浓度。3、4号菌剂处理对植株生理生化指标影响。4号菌剂处理后,‘南丰蜜橘’植株处理组与对照组在茎粗,株高,冠径及总分枝数方面差异显著,相比对照分别提高27.03%,30.07%,75.01%,88%,结果表明4号菌剂能够促进植株生长。矿质元素测定结果表明4号菌剂处理可提高‘沃柑’植株矿质元素含量,尤其是K元素,处理组与对照组相比K元素含量提高了 16.34%。‘南丰蜜橘’对照组植株叶片的Ca2+、Fe3+、Zn2+和实验组含量差异显著,且对照组比处理组含量分别高21.82%,13.27%,43.36%,可能是4号菌剂影响了‘南丰蜜橘’植株对矿质元素的吸收。4号菌剂处理可提高植株叶绿素含量和净光合速率。‘南丰蜜橘’,‘沃柑’植株处理组与对照相比叶绿素含量分别提高了26.70%,31.05%。4号菌剂处理可提高植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,处理组在24 h时,PAL含量比对照提高了 35.26%。4号菌剂处理组植株的超氧化物酶(SOD)活性在24h时,比0h时提高了 18%。4号菌剂处理组植株根部扫描电镜结果发现褐变部位外层表皮细胞结构不完整,细胞壁遭破坏,呈不规则形态,可能丧失运输水分和无机盐的功能。说明4号菌剂处理后促发的新根具有正常根系的生理功能,有助于植株根系正常功能的发挥,可能提高植株根系活力。4、抗性相关基因表达量分析。4号菌剂处理后36 h时,病原诱导启动子GST1的表达量要高于对照组,表明植株可能启动了相关抗病基因的表达,有助于增强抗逆性。WRKY转录因子家族对植株抗病过程具有重要意义,其中处理组WRKY22转录因子的表达丰度持续提高;处理组WRKY24转录因子表达量先升后降,之后又上升,并且在36 h时表达量高于对照组;处理组WRKY33转录因子在0-12 h时间段表达上调,之后表达量下降,在36 h时表达量高于对照组;表明4号菌剂处理有助于提高上述基因表达量,增强植株抗性。PR1基因是植物诱导系统抗性的重要基因,研究发现4号菌剂处理不能激活PR1基因和WRKY29基因表达,对HSP90基因表达具有抑制效果,说明PR1基因和WRKY29可能不响应4号菌剂的处理。
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