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鳗鲡是我国重要的经济养殖鱼类,但大规模集约化的养殖方式使得鳗鲡病害发生日益频繁,其中细菌性疾病是造成养殖鳗鲡重大损失的主要病原菌。细菌性疾病种类繁多,因而只针对单一菌种研制的鳗鲡亚单位疫苗常存在保护效率偏低、有效保护范围有限等问题,难以在水产养殖实践中推广。在本课题组已有的研究基础上,此次试验选取病原性创伤弧菌和嗜水气单胞菌作为代表菌株,通过基因提取试剂盒提取细菌基因组DNA,参考GenBank数据库中已提交的创伤弧菌和气单胞菌外膜蛋白基因序列设计引物,PCR克隆获得病原性创伤弧菌OmpU和嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白的基因全长序列。经序列分析后选取外膜蛋白基因所表达的膜外多肽基因序列,通过融合PCR连接两个外膜蛋白基因片段、构建表达载体（pGEX-2T-His-Vibrio-Aero）并进行高效表达;表达产物经纯化后免疫美洲鳗鲡,通过对溶菌酶含量、全血细胞刺激指数、血清抗体效价以及攻毒感染后免疫保护率的测定研究其免疫原性。研究方法与获得的主要结果如下:1.据GeneBank数据库已提交的创伤弧菌和嗜水气单胞菌全长序列中外膜蛋白基因序列左右两端设计引物,继而利用已提取的基因组DNA模板进行创伤弧菌、嗜水气单胞菌外膜蛋白基因全长的扩增。测序100%正确后利用相关蛋白分析软件对两种外膜蛋白基因的亲水性、免疫原性及其结构进行预测,在此基础上选取免疫原性与亲水性均较好的基因序列。采用“两步法”融合PCR技术对两个外膜蛋白基因片段进行体外连接。依据表达载体（pGEX-2T-His）的限制性酶切位点序列,在已连接外膜蛋白基因两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建二联外膜蛋白基因工程重组表达载体（pGEX-2T-His-Vibrio-Aero）。在大肠杆菌（BL21）浓度OD600nm为0.6-1.0时,采用1.0 mM IPTG诱导剂,16℃过夜诱导表达。表达产物经离心柱亲和层析纯化后获得分子量82.2 kD的高纯度蛋白,蛋白经透析复性后冻干成粉末状,密封干燥保存。2.为研究重组外膜蛋白的免疫原性,本研究将180尾美洲鳗鲡平均分为PBS对照组、二联灭活菌苗免疫组和二联表达外膜蛋白免疫组三个组,于免疫后14 d、21 d、28 d和42d丁香油麻醉鳗鲡后断尾采血并采集鳗鲡粘液、肝肾组织,通过测定这4个时间点鳗鲡全血细胞转化、血清中特异性抗体水平和鳗鲡血清、体表粘液、肝脏和肾脏组织匀浆中的溶菌酶含量研究其免疫原性。于免疫后28 d,嗜水气单胞菌（2×108cfu/尾）和创伤弧菌（5×108cfu/尾）分别腹腔注射感染三组鳗鲡以检测二联外膜蛋白的免疫保护作用。结果表明,免疫后28 d攻毒感染结果表明,创伤弧菌和嗜水气单胞菌感染后二联外膜蛋白组的鳗鲡存活率均从第1d开始显著高于对照组,其对两株菌的相对免疫保护率均为50%。与PBS对照组相比,外膜蛋白免疫组鳗鲡的全血细胞转化水平在免疫后28 d时显著高于PBS组;抗体检测结果表明,免疫后14 d、21 d、28 d和42 d,这4个时间点外膜蛋白免疫组的抗体效价均显著高于对照组,于免疫后42d,外膜蛋白组抗体效价显著高于灭活菌组;溶菌酶检测结果表明,不同处理组不同时间段血清、粘液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量存在显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）差异。上述结果表明,鳗鲡源创伤弧菌和嗜水气单胞菌外膜蛋白二联表达产物免疫美洲鳗鲡后可显著提高美洲鳗鲡的特异性及非特异性免疫水平,增强美洲鳗鲡对这两株菌感染的抵抗力。