机体对肿瘤细胞的免疫监视与抗肿瘤免疫应答在肿瘤的发生与发展过程中起重要作用。然而肿瘤通过多种机制逃避机体的免疫监视,如肿瘤细胞抗原性弱,缺乏激发机体免疫应答的必需成分;肿瘤细胞产生负性调节分子,形成负性调节微环境,抑制相关抗瘤免疫应答;肿瘤细胞通过产生FasL诱导肿瘤特异性T细胞死亡,以及肿瘤细胞凋亡诱导免疫耐受等。如何增强肿瘤的抗原性,促进机体对肿瘤细胞的免疫应答是肿瘤免疫治疗研究中急需解决的关键问题。CC族趋化因子21(CCL21)是CC族趋化因子,高表达于人次级淋巴组织高内皮小静脉和淋巴结的T细胞区。其受体CCR7表达于初始T细胞、B细胞、DC细胞及多种肿瘤细胞。目前研究证明淋巴结部位CCL21与其相应受体CCR7的结合,可促进细胞向淋巴结等次级淋巴组织移动,与淋巴细胞归巢以及肿瘤淋巴结转移密切相关。因此,在肿瘤发生发展的过程中,CCL21与CCR7相互作用,虽可促进机体抗肿瘤免疫应答,但又可引起肿瘤细胞向高表达SLC的淋巴结转移。我们前期研究表明转染CCL21显著抑制肿瘤生长,且在肿瘤局部发现T细胞水平明显升高。【目的】基于上述理论,本课题设计采用基因工程技术,构建CCL21真核表达载体,转染肿瘤细胞,使肿瘤细胞表达CCL21,通过旁分泌与自分泌,作用于表达CCR7的肿瘤细胞及免疫细胞,观察肿瘤源性CCL21增强肿瘤细胞免疫原性,探讨CCL21诱导的抗瘤效应及其机制。一、人CCL21真核表达载体的构建与表达1.人CCL21基因克隆与表达载体的构建以正常人脾脏cDNA为模板,RT-PCR技术获取编码CCL21 cDNA,通过去除终止密码子,加入Kozak序列,引入EcoR I和BamH I酶切位点,将其克隆入红色荧光蛋白真核表达载体,获得重组质粒pDsRed2-N1-CCL21,经酶切鉴定及测序分析证实,所克隆和构建的CCL21 cDNA阅读框及连接部位序列正确;2.CCL21真核表达载体转染MCF-7及其表达重组质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,12小时后通过倒置荧光显微镜观察可见细胞胞内红色荧光表达;收集转染细胞培养上清,荧光分光光度计及western blot检测结果表明,CCL21-RFP以分泌型形式表达,并在转染后72小时达到高峰;3.稳定转染重组质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,利用G418筛选,有限稀释克隆化,获得抗性稳定转染细胞株,通过荧光显微镜观察,证实95%以上的细胞表达红色荧光,通过westernblot证实,CCL21持续分泌至上清,命名为MCF-7-CCL21。二、转染CCL21的MCF-7增强MCF-7免疫原性及其机制1.分组1)未转染质粒的MCF-7对照组:MCF-72)转染空载体pDsRed2-N1的MCF-7对照组:MCF-7-vector3)转染CCL21的MCF-7实验组:MCF-7-CCL214)MCF-7-vector与MCF-7混合培养组:MCF-7-vector与MCF-7以1:10比例混合5)MCF-7-CCL21与MCF-7混合培养组:MCF-7- CCL21与MCF-7以1:10比例混合2.方法1)间接免疫荧光流式细胞术检测肿瘤细胞表面HLA-I类分子表达;Western blot观察肿瘤细胞中抗原转运蛋白(TAP-1)表达;2)实时定量PCR检测肿瘤细胞胞内FasL mRNA水平;ELISA检测培养上清中生长转化因子TGF-β含量;3)流式细胞术检测丝裂霉素C诱导肿瘤细胞凋亡;4) PI染色观察凋亡细胞诱导的外周血单个核细胞增殖。3.结果1)与未转染以及转染空载体的对照组比较,转染CCL21的MCF-7表面HLA-I类分子和胞内TAP-1蛋白表达增高,激发PBMC增殖;MCF-7- CCL21胞内FasL合成减少,培养上清中TGF-β含量明显降低,结果提示转染CCL21可增强其免疫原性;2)转染CCL21可促进丝裂霉素C诱导的细胞凋亡,且凋亡细胞诱导的PBMC杀瘤作用增强,表明MCF-7表达的CCL21不仅可促进丝裂霉素C诱导肿瘤细胞凋亡,同时可能提供危险信号,促进肿瘤细胞的免疫原性,有效诱导PBMC杀瘤效应;3)转染CCL21的MCF-7与MCF-7混合培养组与空载体转染混合培养组比较,通过上述指标检测结果表明,肿瘤源性CCL21不仅可促进转染细胞的免疫原性,同时可增强未转染细胞的免疫原性。三、CCL21转染MCF-7对树突状细胞抗原提呈及其凋亡的影响1.分组1)空白对照组:树突状细胞以生理盐水刺激2)MCF-7刺激组:未转染质粒的MCF-7刺激树突状细胞3)MCF-7-vector:转染空载体的MCF-7刺激树突状细胞4)MCF-7-CCL21:转染CCL21的MCF-7刺激树突状细胞2.方法1)DC制备:应用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,培养8 h后吸取悬浮细胞,贴壁细胞加入GM-CSF与IL-4,培养5天2)DC刺激:MCF-7、转染空载体的MCF-7及转染CCL21的MCF-7经过丝裂霉素C处理后作为刺激细胞,分别与DC以1:1比例混合培养48h3)应用多重浓度淋巴细胞分离液分离DC①趋化实验观察各组DC的迁移能力②流式细胞术检测DC吞噬FITC标记葡聚糖③实时定量PCR检测DC的CD80,CD86 mRNA的表达④Western blot检测DC细胞胞内TAP-1的表达⑤应用ANNEXIN-V抗体流式细胞术检测DC凋亡⑥Western blot检测DC内Caspase-3,bcl-2表达⑦萤火虫荧光素酶标记的NF-κB启动子化学发光发检测NF-κB活性4)上述致敏DC与自体淋巴细胞以1:5比例混合培养,7天后收集淋巴细胞。将此淋巴细胞与CFSE标记的MCF-7以1:50比例混合培养,作用24h①PI染色,FCM测定致敏淋巴细胞对CFSE标记的MCF-7胞毒效应②FCM检测表达穿孔素的CD8+T细胞与不表达穿孔素的CD8+ T细胞比例③取培养上清,ELISA检测IFN-γ、TNF-α、IL-103.结果1)与未转染及转染空载体的对照组比较,转染CCL21的MCF-7刺激的DC迁移与吞噬能力均明显增强,胞内TAP-1表达升高,以及CD80,CD86 mRNA表达升高,以上结果提示转染CCL21的MCF-7刺激的DC抗原提呈能力增强;2)转染CCL21的MCF-7刺激的DC凋亡率与Caspase-3表达降低,bcl-2表达升高;3)转染CCL21的MCF-7刺激的DC其NF-κB活性增高;4)转染CCL21的MCF-7刺激的DC诱导的淋巴细胞中表达穿孔素CD8+T细胞增多,对MCF-7胞毒效应明显增强,IFN-γ, TNF-α的分泌增加,而IL-10的分泌减少,提示转染CCL21的MCF-7刺激的DC可有效激活抗肿瘤特异性T细胞,增强抗瘤效应。【结论】通过转染CCL21至肿瘤细胞,可提高肿瘤细胞免疫原性,增强丝裂霉素C诱导的肿瘤细胞凋亡,肿瘤源性CCL21促进树突状细胞抗原提呈,有效诱导抗肿瘤特异性T细胞的杀瘤效应,抑制免疫负性调节因子产生。