【摘 要】
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目的:（1）构建携带人CTLA4-Ig 基因的重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和携带人FasL 基因的重组非增殖腺病毒载体质粒pSuCMV-FasL;（2）重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和重组非增殖腺病毒载体质粒pSuCMV-FasL 体外转染人胚肾293 细胞内,以观察CTLA4-Ig 和FasL 蛋白表达情况;（3）
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目的:（1）构建携带人CTLA4-Ig 基因的重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和携带人FasL 基因的重组非增殖腺病毒载体质粒pSuCMV-FasL;（2）重组非增殖腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和重组非增殖腺病毒载体质粒pSuCMV-FasL 体外转染人胚肾293 细胞内,以观察CTLA4-Ig 和FasL 蛋白表达情况;（3）建立SD→Wistar 系大鼠同种异体原位肾移植模型;（4）将CTLA4-Ig 基因和FasL 基因,在冷保存时经供肾动脉局部灌注转染至供肾体内,观察其对肾移植大鼠生存期的影响,并探讨转CTLA4-Ig 基因和Fasl 基因的转基因治疗诱导大鼠肾移植免疫耐受的可能机理。方法:（1）将含有hCTLA4-Ig 基因的质粒pGEM3ZF-hCTLA4-Ig 质粒经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后,获得人全长CTLA4-Ig cDNA,将该片段与同样经HindⅢ、XbaⅠ双酶切的非增殖腺病毒载体pAdTrack-CMV 在DNA 连接酶作用下进行连接反应,将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,PCR 筛选阳性克隆,命名为pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig。（2）以含有人Fas Ligand 全长cDNA 序列的质粒J28-FasL 为模板,以PCR 方法获得全长FasL cDNA,将该片段与经NheI、SalI 双酶切的非增殖腺病毒载体pSuCMV 在DNA 连接酶作用下进行连接,将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,PCR 筛选阳性克隆,命名为pSuCMV-FasL。上述两个载体用PCR 及RT-PCR 方法检测是否有CTLA4-Ig 基因或FasL 基因整合及mRNA 的表达,并测序检测。（3）将pAdTrack-CMV-hCTLA4-Ig 和pSuCMV-FasL在体外分别转染人胚肾293 细胞株,用RT-PCR 检测其mRNA 表达,Westarn blot检测其蛋白表达。（4）“袖套法”建立大鼠同种异体原位肾移植模型,并进行技术改进。行供体为SD 大鼠、受体为Wistar 大鼠肾移植,随机分为4 组:A 组（空白对照组）,不作任何治疗;B 组（空载体对照组）:冷保存时感染Ad-EGFP（1.0X10~9pfu/ml）;C 组（Ad-CTLA4-Ig 治疗组）:冷保存时感染Ad-CTLA4-Ig（1.0X10~9pfu/ml）;D 组（Ad-CTLA4-Ig+Ad-FasL 治疗组）:冷保存时感染Ad-CTLA4-Ig （1.0X10~9pfu/ml）和Ad-FasL（1.0X10~9pfu/ml）。肾移植术后抽取外周血及移植肾,检测肾功能,ELISA 法检测血清IL-2、IL-10 及IFN-γ的浓度,免疫组化法检测移植肾组织CTLA4-Ig 和FasL 的表达,TUNEL 法检测移植肾淋巴细
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