诺如病毒(Norovirus, N V)是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病原体之一,近年来由诺如病毒引起的疫情暴发与流行逐渐增多,日益成为重要的公共卫生问题。由于诺如病毒尚不能体外培养,且极易发生变异,传统的血清学及免疫学检测方法存在很大局限性,目前以PCR为核心的分子生物学检测方法成为检测诺如病毒的主要研究方向。本研究通过建立常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测方法,对水体样品的前处理进行研究,并运用建立的方法对采集于江苏部分地区的临床、牡蛎和水体样品进行检测与评价,为进一步完善诺如病毒的检测提供依据。同时了解江苏部分地区诺如病毒的污染状况,分析其分子流行病学特征,为诺如病毒的风险评估及分子流行病学调查提供基础数据。一、诺如病毒常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测方法的建立及比较针对诺如病毒衣壳蛋白保守区及ORF1-ORF2连接处的基因序列设计引物、探针,优化反应体系,建立常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法。运用建立的方法对其他肠道病毒进行检测,均无交叉反应,表明该两种方法具有良好的特异性；不同拷贝数的诺如病毒检测结果显示常规RT-PCR检测限为103 copies/μL,荧光定量RT-PCR检测限为102copies/μL。对不同稀释梯度含有GⅠ型、GⅡ型诺如病毒目的基因的标准重组质粒进行荧光定量RT-PCR反应,结果GI型标准质粒在102-108copies/μL范围内有良好的线性关系,标准曲线为Y=40.585-3.301×1gX,相关系数R2达到0.997,扩增效率Eff为100.889%；GⅡ型标准质粒在101～108copies/μL范围内有良好的线性关系, 标准曲线为Y=40.666-3.229×1gX, R2达到0.996, Eff为104.039%;批内变异系数在0.18%-0.57%之间,批间变异系数在0.71%-2.62%之间,表明荧光定量RT-PC R具有良好的重复性。运用建立的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法对22份临床样品进行同步检测,并与南通市疾病预防控制中心的检测结果相比对,常规RT-PCR敏感度、特异度分别为71.43%、100%,符合率达到90.91%；荧光定量RT-PCR检测结果与南通市疾病预防控制中心完全一致。运用建立的两种方法进一步对180份临床样品进行检测,其中常规RT-PCR阳性率为5.56%,符合率达97.22%：荧光定量RT-PCR阳性率为8.33%,符合率达100%；统计分析两种方法的检测率有显著性差异(P<0.05),并对阳性样品测序,结果证实均为诺如病毒。二、水中诺如病毒富集方法的建立及优化采用国内常见的混合纤维素酯滤膜,对人为污染诺如病毒的水样进行病毒富集,优化滤膜的吸附与洗脱过程,建立水体病毒富集方法。在吸附过程中对水样pH值、多价阳离子及离子浓度进行优化,随后在洗脱过程中优化洗脱液及其pH值和浓度。研究结果显示,在吸附水体病毒过程中,当水样pH值为3.5时,病毒平均吸附率为28.96%,吸附效果优于其它pH值；向水样加入Na+、Mg2+、A13+,三种离子的平均吸附率分别48.42%、28.96%、18.28%,Na+吸附效果优于Mg2+和Al3+；当水样中Na+浓度为0.2mol/L时,滤膜吸附效果较好,平均吸附率高达72.15%,优于Na+其它浓度。在洗脱滤膜过程中,1%NaPP-PB-甘氨酸-0.5%吐温80洗脱液较好,平均洗脱率为107.85%,优于其它洗脱液；当NaPP的浓度为0.5%时,平均洗脱率高达119.94%,优于其它浓度的洗脱液；洗脱液的pH值为8.5、9.5、10.5、11.5时,平均洗脱率分别为29.43%、113.54%、134.90%、104.52%,表明当洗脱液的pH值为10.5时,其洗脱效果优于其它pH值。运用建立的混合纤维素酯膜吸附-洗脱法对人为污染10。～103 copies/μL诺如病毒液的待滤水进行富集,通过荧光定量RT-PCR检测,发现10-103copies/μL诺如病毒的待滤水经富集后,均可检出诺如病毒,未经富集的待滤水均未检出诺如病毒,表明该水样富集方法的灵敏度为待滤水中病毒量达10copies/gL三、江苏部分地区诺如病毒分子流行病学分析在2014年1月～2014年12月间采集扬州、南通两地区腹泻病人的临床样品648份,扬州市翠园桥海鲜农贸市场、欧尚超市的牡蛎样品136份以及市区二道河、安敦河和宝带河中水体样品60份,用荧光定量RT-PCR方法对上述样品进行诺如病毒检测。结果显示648份临床样品中,共检测出85份阳性样品,阳性率为13.12%。其中,扬州地区阳性率为19.13%(57/298),南通地区阳性率为8%(28/350),扬州地区诺如病毒的感染率显著高于南通地区(P<0.05)；14岁以下儿童感染率为18.04%(57/316),14岁以上患者感染率为8.06%(22/273),14岁以下儿童的感染率显著高于其它人群(P<0.05)；男性感染率为13.01%(38/292),女性感染率为12.30%(38/309),男、女感染率差异不显著(P>0.05)。136份牡蛎样品中,检测出9份阳性样品,阳性率6.62%。其中翠园桥海鲜农贸市场阳性率为7.64%(5/67)；欧尚超市阳性率为5.80%(4/69),统计分析扬州市两个海鲜销售市场诺如病毒感染率无显著差异(P>0.05)。60份水体样品中,检测出13份阳性样品,阳性率为21.67%。其中二道河水样阳性率为10%(2/20),安敦河水样阳性率为20%(4/20),宝带河水样阳性率为35%(7/20),统计分析扬州市区三道河流诺如病毒污染率无显著差异(P>0.05)。基于诺如病毒衣壳蛋白保守区的基因序列,应用MEGA5.0软件对43份阳性临床样品和1份阳性水体样品中诺如病毒进行基因分型,检出GI型诺如病毒2份,包括GI.2、GI.6亚型；GⅡ型诺如病毒42份,包括GIIA GII.6、GII.8、GII.17四种基因亚型。其中GⅡ.4亚型有32份,占所有基因型别的72.73%,并与世界流行株GII.4/2006 variant和GII.4/2010在同一分支上,同源性为97%。1份阳性水体样品中诺如病毒与临床样品中的GII.4亚型同源性高达100%,说明人类诺如病毒感染与水源可能有着密切关系。同时发现1份GI.2/GII.8间混合感染的临床样品,为我国首次发现该两种亚型间的混合感染。