本研究分为以下二部分： 第一部分：钩端螺旋体病疫苗相关外膜蛋白的研究 钩端螺旋体属于螺旋体目螺旋体科钩端螺旋体属。其中致病性钩体引起钩体病，此病人畜共患并呈全球分布。人通过直接或间接接触感染动物的尿液而感染。钩体病的临床特点为高热、头痛、寒战、乏力、淋巴结肿大和明显的肌肉疼痛。重者可并发肺出血、黄疸、脑膜脑炎和肾功能衰竭等。为更好的防治钩体病，疫苗的研究一直是钩端螺旋体研究的重点。杨宏亮等首先以完成测序的问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株(56601株)和哥本哈根型FiocruzL1-130株等的全基因组序列为基础，运用生物信息学方法，结合转录组学、比较基因组学方法，筛选出了226个可能的疫苗候选基因。 本实验从中选择了9个预测表达于外膜的疫苗候选基因(LA1100、LA0301、LA3469、LA3744、LA1507、LA2208、LA2757、LA3506、LA0957)进行了克隆表达纯化，得到了九个相应的重组蛋白并制备了相应的抗体。运用此纯化的蛋白，通过westernblot检测了这9个蛋白在钩端螺旋体全菌疫苗免疫后金黄地鼠的血清中抗体的产生情况，结果表明除LA3506外，其余8个重组蛋白的抗体均能在血清中检出。 本课题对其中LA3744和LA1100两个基因所编码蛋白进行了深入研究。PCR和Westernblot检测了它们在15个中国流行的血清群代表株中的保守性，发现这两个基因及其编码的蛋白在中国流行的15个血清群代表株的14株中均有相当高的保守性，且在非致病性双曲钩端螺旋体未检出。荧光激活的细胞分选(FACS)、表面免疫荧光(surfaceimmun of luorescence)及TritonX-114分离钩体膜组分等3种方法检测编码蛋白的亚细胞定位，证实这两种蛋白是钩体表面暴露蛋白，但LA3744所编码pL40蛋白只存在于外膜，而LA1100编码蛋白PL61在外膜和周浆间隙均有分布。ELISA分别检测感染钩端螺旋体的小鼠、豚鼠和金黄地鼠不同时间段血清中这两个重组蛋白抗体滴度，三种血清中都能检出pL40抗体，而且在从第7天到第28天不同感染时间的血清其抗体滴度逐渐增高，说明当致病性钩体56601株感染哺乳动物时，有pL40蛋白表达。据此推测pL40可能在钩体致病中发挥作用。由于其在致病株中的保守性以及其为螺旋体中的特有蛋白，因此可以作为一个有价值的诊断抗原和疫苗候选蛋白进行进一步的研究。与PL40蛋白不同，在这三种血清中均未检出PL61抗体。为了检测PL61蛋白在钩端螺旋体感染时是否表达，分离体内感染的钩体进行westernblot，也未检出该蛋白表达，此蛋白可能为钩体体外特异表达的蛋白，对此蛋白进行进一步研究有助于在分子水平阐明钩端螺旋体适应体内外复杂环境的调控机制。 第二部分：钩端螺旋体不同传代次数的致病株与减毒株表达谱差异的研究 钩端螺旋体由于缺乏有效的遗传工具，对其研究，尤其对其致病机制的研究还较困难，因此对其致病机理的研究还不是很深入。本实验室于2004年根据2002年完成的钩端螺旋体的全基因组测序工作注释的ORFs设计了钩端螺旋体的cDNA芯片，并根据此芯片进行了毒力株不同传代次数之间表达谱差异的研究。本试验拟通过该芯片，分别研究了不同传代的毒力株和减毒株间表达谱的差异。 钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株毒力株56601株(中赖)与减毒株钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株IPAV(法赖)虽然遗传背景上相似，但毒力却有很大的差别。本试验以37℃为试验的培养条件，分别以原代培养的钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株毒力株56601和体外传代20次的56601株为测试株，以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株IPAV株为对照株，利用钩端螺旋体的cDNA芯片测试了不同传代次数毒力株与减毒株芯片表达谱的差异。结果表明，无论是原代还是第二十代毒力株和减毒株的表达谱均具有明显的差别。原代56601株上调表达的基因有103个，下调表达的有85个；第二十代56601株上调表达的基因有217个，下调表达的有193个。这些差异表达的基因在功能上可以分12类，分属于致病相关基因、无机离子运输基因、信号传导机制相关基因、细胞壁/膜合成相关基因、细胞周期调控基因、蛋白质翻译后修饰及折叠基因、防御机制相关基因、新陈代谢相关基因、细胞动力相关基因、胞内分选及分泌相关基因、信息存储及加工基因及其它功能基因。这些差异表达的基因可能与钩端螺旋体致病有关。 从芯片结果还可看出，体外传代二十次的钩端螺旋体体内发生了较为明显的变化。变化较为明显基因包括细胞动力相关基因、细胞壁及膜生成相关基因、信号转导相关基因及新陈代谢相关基因等，这些可能与以前所报道的细胞膜分子的变化及细胞形态的变化及细胞的致病力有关，也可能是钩端螺旋体适应体外环境的结果。