【摘 要】
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本研究以小桐子(Jatropha curcas L.)为实验材料,优化了以小桐子叶柄和叶脉为外植体的高效再生体系。实验结果表明:小桐子叶柄和叶脉均易于诱导愈伤组织,其中以MS+6-BA0.05mg
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本研究以小桐子(Jatropha curcas L.)为实验材料,优化了以小桐子叶柄和叶脉为外植体的高效再生体系。实验结果表明:小桐子叶柄和叶脉均易于诱导愈伤组织,其中以MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L效果最佳;一周后转入芽诱导培养基,最佳芽诱导和增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L;将长到2-3cm高的芽转入生根培养基中培养,得到最佳的生根配方为1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L。这为遗传转化奠定了良好的基础。
测定了小桐子叶脉愈伤组织对Kan的抗性,得出小桐子叶脉愈伤组织对Kan的敏感的最佳浓度为200mg/L。把来自拟南芥的控制植物茎伸长的GAI基因作为目的基因,通过基因枪法和农杆菌法分别转化小桐子叶脉愈伤组织进行小桐子的遗传转化研究。
在应用农杆菌介导转化法时,研究了转化材料、侵染时间、共培养时间、共培养温度、抑菌素浓度、乙酰丁香酮的浓度等对农杆菌遗传转化效率的影响。实验结果表明:培养5d的叶脉愈伤组织,侵染5min,20℃,共培养2d,Cef浓度200mg/L,乙酰丁香酮浓度200μmol/L的条件下,遗传转化效率最好,不但可以有效抑制农杆菌的生长,而且愈伤组织侵染后可继续生长。两周后接种到具有选择压的MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+Kan200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L培养基中进行抗生分化筛选。分化后长至2-3cm的抗性芽转入具有选择压的1/2MS+IBA0.2mg/L+Kan200mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L生根培养基中生根。
利用基因枪法进行的研究中发现:预培养时间、轰击距离对小桐子的遗传转化率有较大影响。获得了基因枪转化小桐子的相关参数:叶脉愈伤组织预培养2d,650psi,轰击距离6cm,轰击1次。
将所得到的抗性苗提取叶脉DNA进行PCR检测,呈阳性。扩繁后再次提取叶脉DNA进行PCR检测,仍然呈阳性。初步证明GAI基因已经成功整合到小桐子的基因组中,并可稳定遗传。提取DNA进行Southern Blot鉴定:非转化的再生植株无Southern杂交信号,而转化后植株DNA经XbaI单酶切后,Southern杂交后有明显的杂交信号。
表明目的基因GAI已成功整合到到小桐子基因组中。
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