细胞周期是连续分裂的细胞一次有丝分裂结束开始到下一次分裂结束,由一个细胞分裂为两个相同子细胞的过程,是细胞最基本的反应,为了保证复制的精确性,细胞进化出了检验点的监督机制,监控着细胞周期中各个事件的有序运行。　　 有丝分裂过程中一系列精确适时的磷酸化和去磷酸化反应是正常分裂过程的核心事件保证有丝分裂的正确进行。从纺锤体检验点发挥作用的分子机制和SAC的主要成分来看,蛋白激酶在其中起了关键作用,这些激酶在有丝分裂中被有序地招募到检验点信号的开始位点一着丝粒上,很可能是通过组成激酶级联反应来转导和放大动粒上的检验点信号,从而保证染色单体被正确分到两个子细胞中。其中Mps1激酶就是纺锤体组装检验点中的重要成分之一,它的磷酸化状态决定着Mps1蛋白与着丝粒的结合与解离。　　 与磷酸化相对应存在,去磷酸化修饰在细胞周期中同样起着重要的调控作用,共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。蛋白磷酸酶可以通过将磷酸基团脱去的方式发挥反向作用,这种可逆的磷酸化作用可以保证信号分子功能的平衡稳定。在我们前期的研究中发现,Mps1激酶特异性的磷酸酶是PPM1A和PPM1B。　　 PPM1A蛋白是一种常见的磷酸酶,是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PPM家族的成员,具有镁离子或锰离子依赖性,为单体磷酸酶,由一个催化亚基构成,定位于胞浆和细胞核,可以特异性的结合很多底物进行去磷酸化修饰作用。　　 为了进一步研究PPM1A通过Mps1的去磷酸化作用在细胞周期中的作用,我们分为体外和体内两种途径进行研究。在体外的研究是:向293T细胞中转染PPM1A和Mps1表达载体进行瞬时表达,确定PPM1A对于Mps1激酶的作用。在体内的研究采用条件敲除小鼠模型制作技术,将构建好的PPM1A基因条件敲除载体转染到ES细胞中,筛选出发生同源重组的细胞克隆,通过显微注射技术将阳性细胞克隆注射至囊胚中,转移至假孕小鼠子宫中最终发育形成嵌合体小鼠,以便在动物个体、组织水平上研究PPM1A基因功能。　　 实验方法:(一)分别将空载体、PPM1A、PPM1A(R174G)、PPM1B、PPM1B(R179G)表达载体与MPS1表达载体共同转染至293T细胞中,WesternBlot检测表达情况。(二)构建PL253、PL451、PL452三种同源重组用重组质粒。(三)利用重组质粒及PPM1A基因相应的BAC,构建条件敲除载体。(四)将处理好的条件敲除载体通过电转转至ES细胞中。(五)用G418药物对细胞克隆进行筛选。(六)将存活下来的ES细胞克隆提取基因组DNA,进行长距离PCR筛选发生正确同源重组的ES细胞克隆。(七)将最终筛出的细胞克隆用显微注射的方法注射至小鼠囊胚中,移入假孕母鼠子宫发育。　　 结果:1)PPM1A和PPM1B对于Mps1的迁移率有明显的改变,对应的突变体则没有同样的改变。2)构建PPM1A条件敲除载体。3)将验证正确的载体转入ES细胞中筛选出发生正确同源重组的细胞克隆。4)在筛选发生同源重组的ES细胞克隆时,确定了一对筛选效率较高的引物。5)利用显微注射技术将中靶ES细胞注入小鼠囊胚中,转移至假孕小鼠子宫,最终得到嵌合体小鼠。