胆囊收缩素（cholecystokinin ,CCK）是一种脑肠肽,八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide,CCK-8）在CCK分子结构中是起主要功能作用的氨基酸片段,CCK-8通过与靶细胞膜上的特异性受体结合而发挥细胞调节作用,并与痛觉感受、情绪、记忆、神经保护、中枢呼吸控制和心血管紧张性等功能相关。近年来,人们注意到CCK-8对免疫细胞功能活性有影响,有研究发现,人及动物免疫细胞可表达CCK、CCK受体,CCK-8具有调节免疫细胞增殖、趋化、黏附、免疫杀伤、产生炎性介质及细胞因子等多种功能。目前,CCK-8对免疫功能的调节多集中于研究其对天然免疫应答的调节作用,而CCK-8对适应性免疫应答的调节作用研究甚少,CCK及其受体在淋巴细胞中表达,提示其可能通过自分泌或旁分泌的形式调节淋巴细胞的某些功能,参与适应性免疫应答的调节。辅助性T细胞（ Th ）在调节细胞免疫和体液免疫反应中起关键作用,根据分泌细胞因子的不同,Th细胞分为Th1与Th2两种类型。Th1细胞以分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α等细胞因子为特征,介导细胞免疫应答;Th2细胞以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等细胞因子为特征,介导体液免疫应答,二者均由相同的前体细胞Th0,又称未致敏Th细胞（ naive T cells,或precursor T cells）极性分化而来,Th1和Th2细胞通过分泌细胞因子,彼此相互调节,保持平衡。Th1/ Th2失衡参与多种疾病的发生发展,如过敏性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病,类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病等免疫风湿性疾病,移植排斥反应,感染性疾病和肿瘤等。通过干预Th1/ Th2失衡来治疗某些疾病已成为各学科领域研究的热点。本室的前期研究发现,CCK-8具有一定的抗内毒素休克及缓解类风湿性关节炎作用,该作用是否与调节Th1/Th2细胞有关尚属未知。我们的课题将从整体实验到细胞水平研究CCK对Th1/Th2细胞功能的调节作用及其机制,旨在阐明CCK-8在神经免疫网络中的生理及病理作用,为Th1/Th2失衡相关性疾病的临床治疗提供实验依据。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase , MAPK）是细胞内信号蛋白网络中的重要成员,广泛分布于各类细胞的胞浆及胞核中,参与基因表达调控、细胞稳态及机体多种生理病理过程。目前在真核生物细胞中已经明确了4个MAPK亚家族:胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase , ERK）1/ 2 , p38 MAPK, c-J un氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases , JNK）及ERK5。MAPK在生物进化过程中具有高度保守的三级激酶级联,即MAPKKK-MAPKK-MAPK。不同的细胞外刺激可激活不同的MAPK信号通路,通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。近年发现,MAPK信号通路中ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK在固有性免疫和适应性免疫应答中起着重要调节作用,可以诱导未致敏T细胞向Th1或Th2细胞分化,从而引发不同的免疫反应,迄今尚未发现ERK5参与调控T细胞极性分化。CCK-8可激活胰腺腺泡细胞、胰腺癌细胞株及大脑孤束核内ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK及其信号通路,参与胰腺的增殖分化和炎症反应、参与摄食等机能调节反应,提示,CCK与MAPK蛋白之间存在着密切的关系。孟爱宏、黄新莉等的研究发现CCK-8干预内毒素休克大鼠肺脏和脾脏MAPK家族蛋白的活化,但CCK对适应性免疫应答中MAPK蛋白的调节作用及其与Th1/Th2极化的关系尚未见报道。我们的研究还将对这一课题进行探讨。除CD4⁺T细胞外,CD8⁺T细胞在体外亦可产生大量Th1型和Th2型细胞因子,但在体内,其主要产生IFN-γ,产生Th2型细胞因子的证据非常少。体内CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞亚群的平衡与Th1/Th2平衡密切相关。因此,我们在观察CCK-8对经KLH免疫小鼠脾细胞Th1/Th2平衡影响的同时,同步观察了CCK-8对外周血和脾细胞中T淋巴细胞亚群的影响,旨在探讨CCK-8是否通过干预淋巴细胞亚群平衡影响Th1/Th2平衡。抗原进入机体后,免疫细胞活化,参与免疫应答,这时CD4⁺/CD8⁺、Th1/Th2平衡是维持机体免疫稳态的重要条件之一。CD4⁺T细胞过度活化和Th2优势应答参与了以哮喘为代表的免疫性疾病的发生发展。肺组织由于独特的解剖学特点,是免疫性疾病易于累及的脏器之一。那么,KLH引发的小鼠Th2优势反应是否会引起继发的免疫性肺损伤,CCK-8对这种损伤作用如何,目前还尚未见报道,为探讨这一问题,我们同步进行了五组小鼠肺组织的HE染色,对其病理变化进行观察,初步探讨CCK-8对免疫性肺损伤的保护作用。1 KLH诱导小鼠脾细胞Th1/Th2失衡目的:建立一种具有一定特征的Th1/Th2失衡动物模型,为今后的研究打下基础。方法:⑴、Balb/C小鼠分为一次免疫或二次加强免疫组,分别给予背部皮下注射梯度浓度的KLH﹢CFA,于指定时间点宰杀小鼠获得脾细胞体外培养,培养基中给予或不给予同种抗原再刺激,ELISA法检测培养24、48、72、96 h后其上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12p40和Th2型细胞因子IL-4、IL-5分泌量,观察①、KLH免疫脾细胞体外分泌各种细胞因子是否需要给予同种抗原再刺激;②、KLH免疫脾细胞体外分泌各种细胞因子的时间效应;③、不同免疫方式和不同剂量KLH诱导小鼠脾细胞Th1/Th2失衡的特点。⑵、给予Balb/C小鼠背部皮下注射中等剂量的KLH﹢CFA并二次加强免疫,于指定时间点宰杀获得小鼠血清,ELISA法检测Th1型抗体IgG2a和Th2型抗体IgG1水平,评价小鼠体内Th1/Th2失衡的特点。结果:⑴、各组KLH免疫小鼠均出现不同程度的脾脏肿大,脾细胞计数增高,但不同剂量及免疫次数的小鼠之间脾细胞计数无明显统计学差异（KLH组脾细胞计数为（1.68±0.80）×10⁸～（2.36±0.90）×10⁸,P﹤0.01或0.05 vs control（（0.39±0.13）×10⁸））。⑵、经KLH免疫小鼠体外未给予同种抗原再次刺激仅产生少量细胞因子,有些甚至低于检测低限,但体外给予同种抗原再次刺激后细胞因子浓度明显增高。⑶、四种细胞因子中IL-2分泌量于24 h即明显增高,于48 h达到分泌高峰（（179.31±103.76）ng/L）,以后逐渐下降,至96 h与未刺激组相比已无明显统计学差异。IL-4、IFN-γ和IL-5在24 h轻度增高,以后逐渐上升,至96 h达到分泌高峰（IL-4为（94.17±79.50）ng/L,IFN-γ为（64.92±20.00）ng/L,IL-5为（643.12±396.05）ng/L）。各时间点脾细胞上清中IL-12 p40分泌量均较低,与对照组相比无统计学差异。⑷、不同剂量单次或二次免疫均可致四种细胞因子发生不同程度增高,其中125μg二次免疫组细胞因子分泌水平明显高于其他各组（IL-4为（227.26±63.93）ng/L,IFN-γ为（79.80±21.46）ng/L,IL-5为（1199.52±106.44）ng/L,IL-2为（328.50±118.77）ng/L,P﹤0.01 vs othergroups）。⑸、不同剂量单次或二次免疫均可致小鼠脾细胞IL-4:IFN-γ比值不同程度增高(KLH组为（0.99±0.33）^2.87±0.39, P﹤0.01或0.05 vs control（0.25±1.06）),其中125μg二次免疫组增高最为明显（2.87±0.39）。（6）、KLH免疫小鼠血清中IgG2a、IgG1发生不同程度增高（KLH组IgG1为（1351.97±26.13） ng/L、IgG2a为（837.46±239.33）ng/L,对照组IgG1为（389.30±83.45）ng/L、IgG2a为（458.46±51.12）ng/ L ,P﹤0.01或0.05 vs control）,其中IgG1增高更为明显。结论:以Balb/C小鼠为研究对象,给予KLH﹢CFA可诱导小鼠脾细胞发生Th2型优势反应;体外培养的脾细胞必须给予同种抗原再刺激方可产生较高水平细胞因子,细胞因子的产生具有时间效应:IL-2是较早产生的细胞因子,IL-4、IL-5和IFN-γ产生较晚;中等剂量二次免疫可增加脾细胞产生细胞因子的强度。2 CCK-8对经KLH免疫小鼠脾细胞Th1/Th2极化的影响目的:探讨CCK-8对Th1/Th2细胞的调节作用。方法:⑴、整体实验部分:小鼠随机分为五组（n=4）:①KLH组,第1天背部皮下注射KLH﹢CFA 0.1 ml /20g,含KLH125μg,第7天以等量KLH﹢CFA皮下注射加强免疫。②KLH﹢CCK 1 nmol组,③KLH﹢CCK 5 nmol组,④KLH﹢CCK 10 nmol组,免疫方法同KLH组,于第7天加强免疫同时给予CCK-8腹腔注射,每日1次,持续7天。⑤对照组,每次均注射等体积生理盐水。第15天处死小鼠,ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-5水平,即时提取脾细胞总RNA,RT-PCR法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5mRNA表达;ELISA法检测血清中Th1型抗KLH抗体IgG2a和Th2型抗KLH抗体IgG1水平。⑵、体外实验部分:Balb/c小鼠于第1天背部皮下注射KLH﹢CFA 0.1 ml /20g,含KLH 125μg,并于第7天以等量KLH﹢CFA加强免疫,于第15天宰杀获得脾细胞体外培养,并给予同种抗原再刺激。①、KLH特异性脾细胞分为KLH组（培养基中仅加入KLH）和KLH﹢CCK组(加入KLH前10 min加入CCK-8,终浓度为1×10^-8 mol/L),分别于加KLH后6h、12h、24h、48h、72h、96h收集培养上清,ELISA法检测上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5含量,以上每组n=3。②、KLH特异性脾细胞分为5组,KLH组:培养基中仅加入KLH,余每次均加入等体积PBS,KLH﹢CCK组:加入KLH前10 min加入CCK-8,终浓度分别为1×10^-12 mol/L、1×10^-10 mol/L、1×10^-8 mol/L、1×10^-6 mol/L,以上每组n=3,于加KLH后24 h收集培养上清,ELISA法检测上清中IL-2、IL-4含量;于加KLH后96h收集培养上清,ELISA法检测上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5含量。结果:⑴、体内实验部分:①、未给予KLH免疫的Balb/C小鼠,分泌IFN-γ、IL-2、IL-4水平较低,但分泌一定量的IL-5。KLH免疫使小鼠脾细胞分泌Th1/Th2型细胞因子水平明显增高,其中以IL-5增高最为明显（KLH组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5含量分别为（70.12±9.98）ng/L,（264.53±98.77）ng/L,（200.96±20.51）ng/L,（1147.19±271.04）ng/L,IL-4/IFN-γ为2.91±0.49,对照组IFN-γ、IL-2、IL-4低于检测低限,IL-5含量为（45.84±12.13）ng/L,P<0.01 vs control）)。KLH免疫同时给予不同剂量CCK-8可使KLH免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2含量进一步增加而使IL-4、IL-5含量降低,降低IL-4/IFN-γ比值（KLH+ CCK1 nmol,5nmol,10nmol组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5含量分别为（122.11±57.47）ng/L,（286.11±113.75）ng/L,（112.64±32.80）ng/L,（508.21±139.84）ng/L;（131.11±50.81）ng/L,（330.53±49.15） ng/L,（107.53±33.18） ng/L,（372.73±147.38） ng/L;（155.10±29.99） ng/L , （388.27±35.44） ng/L , （98.77±26.00） ng/L ,（378.80±187.65） ng/L;IL-4/IFN-γ比值分别为1.11±0.55,1.098±1.01,0.65±0.22, P<0.01或0.05 vs KLH）。②、未给予KLH免疫的Balb/C小鼠脾细胞内IFN-γ、IL-2mRNA表达水平较低,有一定水平IL-4和IL-5mRNA表达。KLH免疫使小鼠脾细胞内IFN-γ、IL-2、IL-4mRNA表达增高（P<0.01或0.05 vs control）,IL-5mRNA表达亦有所增高,但与对照组相比无明显统计学差异。KLH免疫同时给予不同剂量CCK-8可使KLH免疫小鼠脾细胞内IFN-γ、IL-2mRNA表达进一步增强,而使IL-4、IL-5mRNA表达减低（P<0.01或0.05 vs KLH）。③、KLH免疫小鼠血清中IgG2a、IgG1发生不同程度的增高（P<0.01 vs control）,KLH免疫同时给予不同剂量CCK-8可使血清中IgG1水平减低而使IgG2a水平增高（P<0.01或0.05 vs KLH）。⑵、体外实验部分:①、体外给予KLH免疫小鼠脾细胞同种抗原再刺激,IFN-γ、IL-4和IL-5水平随时间延续逐渐增高,IL-2分泌在48h达高峰,以后逐渐减低。给予KLH同时给予1×10^-8 mol/L CCK-8使细胞培养上清中IL-4水平进一步增高,以6h和12h组最为明显;同时使IFN-γ水平亦进一步增高,以96 h最为明显;IL-2含量在各时间点较同一时间点KLH组明显增高（P<0.01或0.05vs KLH）;在所有时间点1×10^-8mol/L CCK-8对培养上清中IL-5含量均无明显影响。②、体外给予KLH免疫小鼠脾细胞同种抗原再刺激同时,给予不同剂量CCK-8可剂量依赖性地提高脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-4释放,而对IL-5含量均无明显影响。结论:⑴、整体实验水平CCK-8使KLH免疫小鼠脾细胞体外分泌Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2增强,分泌Th2型细胞因子IL-4、IL-5减弱;使IFN-γ、IL-2mRNA表达增加,IL-4、IL-5mRNA表达减少;使外周血中Th1型抗KLH抗体IgG2a增高,Th2型抗体IgG1下降。表明,CCK-8可促进KLH免疫小鼠体内Th1反应,使Th2优势反应向Th1方向转变。⑵、体外实验CCK-8剂量依赖性地促进KLH免疫小鼠脾细胞合成IFN-γ、IL-2和IL-4,但对细胞因子的促进作用存在时间差异,CCK-8促进IL-4合成发生于抗原刺激早期,促进IFN-γ合成发生于抗原刺激晚期,促进IL-2合成既发生于抗原刺激早期也发生于抗原刺激晚期,CCK-8对IL-5合成无明显作用,提示,CCK-8促进未致敏和/或记忆性T细胞分泌细胞因子,并促进Th1细胞分化和分泌Th1型细胞因子。体内外实验表明CCK-8具有调节抗原诱导的Th1/Th2失衡的作用,因此CCK-8可能参与了Th1/Th2平衡相关的免疫生理和免疫病理过程,在Th1/Th2失衡疾病的治疗中具有一定的应用前景。3 CCK-8对MAPK调节KLH免疫小鼠脾细胞Th1/Th2极化的影响目的:探讨MAPK通路在KLH免疫诱导小鼠脾细胞Th1/Th2极化过程中的作用和CCK-8对其的影响。方法:⑴、Western Blot检测小鼠脾细胞内MAPK活性:小鼠随机分为KLH免疫组（免疫方法同第二部分）和对照组,均于第15天宰杀,常规制备脾细胞。免疫组小鼠脾细胞体外均给予KLH再刺激并分为KLH组、KLH﹢CCK组、KLH﹢CCK﹢CR1409组、KLH﹢CCK﹢CR2945组、KLH﹢PD98059组、KLH﹢SP600125组,对照组给予等体积PBS,以上各组n=3,均于孵育后3小时收集细胞提取细胞总蛋白,Western Blot法检测小鼠脾细胞内p38 MAPK、ERK1/2、JNK1/2活性。⑵、检测CCK-8对PD98059、SP600125干预的KLH免疫小鼠脾细胞合成IL-2、IFN-γ、IL-4的影响:经KLH免疫小鼠脾细胞体外均给予KLH再刺激并分为:KLH组、KLH﹢PD98059组、KLH﹢SP600125组、KLH﹢CCK组、KLH﹢CCK﹢PD98059组、KLH﹢CCK﹢SP600125组,以上每组n=3,于加KLH后48h收集培养上清,ELISA法检测IL-2含量;96h收集培养上清,ELISA法检测IFN-γ、IL-4含量。结果:⑴、各组非磷酸化p38 MAPK水平无明显差异。对照组p-p38 MAPK水平较低,KLH组p-p38MAPK水平明显升高,较对照组增加了约5.21倍（P<0.01 vs control）。KLH﹢CCK组p-p38MAPK水平约为对照组的3.15倍,较KLH组明显减低（P<0.05 vs KLH组）。KLH﹢CCK﹢CR1409组和KLH﹢CCK﹢CR2945组p-p38MAPK表达水平分别约为对照组的4.82倍和3.38倍（P<0.05 vs KLH﹢CCK组）,部分逆转了CCK-8对p38 MAPK活性的抑制作用。⑵、对照组p-ERK1/2水平较低,KLH组p-ERK1/2表达分别约为对照组的7.97和6.64倍,较对照组明显增加（P<0.01或0.05 vs control）。KLH﹢CCK组p-ERK1/2水平分别约为对照组的17.40倍和21.57倍,较KLH组明显增高（P<0.05 vs KLH组）。KLH﹢CCK﹢CR1409组和KLH﹢CCK﹢CR2945组p-ERK1/2约为对照组的11.75、20.10倍和11.69、14.90倍,较KLH﹢CCK组明显下降（P<0.01或0.05 vs KLH﹢CCK组）。KLH﹢PD98059组p-ERK1/2表达受抑,分别约为对照组的0.31和0.52倍。⑶、对照组p- JNK1/2水平较低,KLH组p- JNK1/2表达增多,分别约为对照组的4.21和5.25倍,但两组之间无明显统计学差异。KLH﹢CCK组p- JNK1/2表达增多,分别约为对照组的482.73和337.78倍（P<0.01 vs control和KLH组）,KLH﹢CCK﹢CR1409组和KLH﹢CCK﹢CR2945组p- JNK1/2表达较KLH﹢CCK组减低,分别是对照组的321.28、273.64倍和74.09、25.64倍（P<0.01 vs KLH﹢CCK组）。KLH﹢SP98059组p-JNK1/2表达受抑,分别为对照组的3.71和3.80倍。⑷、体外给予KLH免疫小鼠脾细胞同种抗原再刺激同时给予PD98059和SP600125明显抑制脾细胞合成IL-2、IL-4和IFN-γ,PD98059降低KLH免疫上调的IL-4/IFN-γ比值,SP600125使IL-4/IFN-γ比值进一步增高;CCK-8使KLH免疫小鼠脾细胞合成IL-2、IFN-γ增多（P<0.01 vs KLH组）,对IL-4合成无明显影响,使IL-4/IFN-γ比值下降（P<0.01 vs KLH组）,KLH﹢CCK﹢PD98059组和KLH﹢CCK﹢SP600125组脾细胞合成IL-2、IL-4及IFN-γ较KLH﹢PD98059组及KLH﹢SP600125组增多,但低于KLH﹢CCK组。结论:⑴、KLH免疫小鼠的脾细胞内p38 MAPK、ERK1/2、JNK1/2活化,其中以p38 MAPK和ERK1/2活化较为明显;ERK、JNK抑制剂明显抑制KLH免疫小鼠脾细胞合成IL-2,IL-4、IFN-γ,JNK抑制剂提高KLH上调的IL-4/IFN-γ比值,ERK抑制剂减低KLH上调的IL-4/IFN-γ比值,表明KLH通过激活ERK1/2和JNK1/2促进T细胞活化和极性分化,其中ERK1/2活化使Th1/Th2平衡向Th2方向转变,JNK1/2活化使Th1/Th2平衡向Th1方向转变。⑵、CCK-8抑制KLH免疫小鼠脾细胞内增强的p38 MAPK活性,进一步促进ERK1/2和JNK1/2磷酸化;CCK-8促进KLH免疫小鼠脾细胞合成IL-2、IFN-γ,对IL-4合成无明显影响,减低IL-4/IFN-γ比值,KLH﹢CCK﹢PD98059组和KLH﹢CCK﹢SP600125组脾细胞合成IL-2、IL-4及IFN-γ较单纯KLH﹢PD98059组及KLH﹢SP600125组增多,但低于KLH﹢CCK组,说明CCK-8通过调节ERK1/2和JNK1/2及其他信号通路促进KLH免疫小鼠脾细胞体外活化和极性分化,并使Th1/Th2平衡向Th1方向转变。⑶、CCK-8抑制KLH免疫小鼠脾细胞内p38 MAPK活化及促进ERK1/2和JNK1/2活化的作用可为其受体拮抗剂所抑制,说明CCK-8是通过其受体调节KLH免疫小鼠脾细胞内MAPK活化的。4 CCK-8对经KLH免疫小鼠T淋巴细胞亚群的影响及其在Th1/Th2平衡调节中的意义目的:探讨CCK-8对T淋巴细胞亚群的影响及其在Th1/Th2平衡调节中的意义。方法:Balb/c小鼠分为五组（n=4）:①KLH组:第1天背部皮下注射KLH﹢CFA 0.1 ml /20g,含KLH125μg,第7天以等量KLH﹢CFA皮下注射加强免疫。②KLH﹢CCK1 nmol组,③KLH﹢CCK5 nmol组,④KLH﹢CCK10 nmol组:免疫方法同KLH组,于第7天加强免疫同时给予CCK-8腹腔注射,每日1次,持续7天。⑤对照组:每次均注射等体积生理盐水。第15天处死小鼠,以流式细胞法测定外周血及脾细胞中CD4+/CD8+阳性百分率;以ELISA法测定其培养上清中IL-4、IFN-γ分泌量;以RT-PCR法检测脾细胞中IL-4、IFN-γmRNA表达;以HE染色测定肺组织病理变化。结果:⑴、KLH免疫明显提高脾细胞培养上清中IL-4及IFN-γ含量,提高IL-4/IFN-γ比值（KLH IL-4:（177.10±24.77）ng/L,control IL-4:（5.06±1.92）ng/L ;KLH IFN-γ:（25.95±2.98）ng/L,control IFN-γ:（5.25±2.49）ng/L;KLH IL-4/IFN-γ:6.87±1.00,control IL-4/IFN-γ:1.00±0.18。P<0.01 vs control）。同时给予CCK-8可使KLH免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ含量进一步增加而使IL-4含量降低,降低IL-4/IFN-γ比值。（1 nmol IFN-γ:（52.09±7.40）ng/L,5 nmol IFN-γ:（71.74±21.66）ng/L,10 nmol IFN-γ:（81.36±13.61）ng/L;1 nmol IL-4:（151.82±28.76）ng/L,5 nmol IL-4:（91.85±18.12）ng/L,10 nmol IL-4:（90.35±11.92）ng/L;1 nmol IL-4/IFN-γ:2.97±0.69,5 nmol IL-4/IFN-γ:1.30±0.30,10 nmol IL-4/IFN-γ:1.13±0.19。各组IFN-γ、5 nmol和10 nmol IL-4、各组IL-4/IFN-γ,P<0.01 vs KLH）。⑵、KLH免疫明显提高脾细胞IL-4及IFN-γmRNA表达（KLH IL-4mRNA AU ratio:0.68±0.13,control IL-4mRNA AU ratio:0.09±0.03;KLH IFN-γmRNA AU ratio:0.25±0.05,control IFN-γmRNA AU ratio:0.09±0.06。P<0.01 vs control）。同时给予CCK-8进一步提高KLH免疫小鼠脾细胞IFN-γmRNA表达（1 nmol:0.36±0.07,5 nmol:0.48±0.08,10 nmol:0.74±0.09, P<0.01或P<0.05 vs KLH）,而使IL-4mRNA表达下降（1 nmol:0.57±0.10,5 nmol:0.47±0.04,10 nmol:0.37±0.11,5 nmol和10 nmol,P<0.05 vs KLH）。⑶、经KLH免疫明显提高小鼠外周血及脾细胞中CD4⁺、CD8⁺T细胞阳性百分率和CD4⁺/CD8⁺比值（外周血KLH CD4⁺:（70.51±1.75）%,control:CD4⁺:（35.28±3.65）%;外周血KLH CD8⁺:（20.13±1.02）%,control CD8⁺:（14.43±2.02）%。脾细胞KLH CD4⁺:（70.95±4.97）%,control:CD4⁺:（29.89±1.83）%;脾细胞KLH CD8⁺:（16.80±1.55）%）,control CD8⁺:（12.09±1.19）%。外周血KLH CD4⁺/CD8⁺:3.50±0.59,control CD4⁺/CD8⁺:2.46±0.29;脾细胞KLH CD4+/CD8⁺:4.24±0.41,control CD4⁺/CD8⁺:2.49±0.33。P<0.01 vs control)。KLH免疫同时给予CCK-8使小鼠外周血及脾细胞中上升的CD4⁺、CD8⁺T细胞阳性百分率下降,同时降低CD4⁺/CD8⁺比值,这种作用具有剂量依赖性（外周血1 nmol CD4⁺:（58.22±4.82）%, 5 nmol CD4⁺:（45.00±3.47）%, 10 nmol CD4⁺:（39.13±2.64）%;外周血1 nmol CD8⁺:（18.31±0.79）%,5 nmol CD8⁺:（15.06±0.86）%;10 nmol CD8⁺:（14.95±1.40）%。脾细胞1 nmol CD4⁺:（52.35±3.37）%,5 nmol CD4⁺:（41.44±6.54）%, 10 nmol CD4⁺:（34.42±2.98）%;脾细胞1 nmol CD8⁺:（15,96±01.3）%,5 nmol CD8+:（15.19±1.45）%,10 nmol CD8⁺:（13.44±1.57）%。外周血1 nmol CD4⁺/CD8⁺:3.18±0.23,5 nmol CD4⁺/CD8⁺:3.03±0.41,10 nmol CD4⁺/CD8⁺:2.61±0.30;脾细胞1 nmol CD4⁺/CD8⁺:3.30±0.83,5 nmol CD4⁺/CD8⁺:2.82±0.81,10 nmol CD4⁺/CD8⁺:2.59±0.43。P<0.01或P<0.05 vs KLH）。⑷、KLH免疫致小鼠肺组织充血、出血、肺泡间隔增厚、上皮细胞增生、大量炎细胞浸润,其中以淋巴细胞为主,伴有少量巨噬细胞。CCK-8减轻KLH免疫小鼠肺组织炎症反应,以10 nmol剂量最为明显。结论:KLH免疫可诱导小鼠CD4⁺、CD8⁺T细胞活性增强,发生CD4+优势反应和Th2优势反应,诱发免疫性肺损伤;CCK-8可使经KLH免疫小鼠的T细胞活性尤其是CD4⁺T细胞活性降低,Th2型细胞因子产生减少,并明显减轻免疫性肺损伤。CCK-8的上述作用提示我们其可通过调节Th1/Th2平衡及T淋巴细胞亚群平衡参与适应性免疫应答,并可能对防治免疫性疾病具有一定意义。结论本研究首次通过整体和体外实验观察到CCK-8对抗原所致小鼠脾细胞Th1/Th2平衡具有调控作用,这种调控作用通过细胞表面CCK受体介导并有MAPK信号通路参与;CCK-8对抗原所致小鼠T淋巴细胞亚群失衡具有调控作用并与其调控Th1/Th2平衡有关;CCK-8可能通过调节Th1/Th2细胞平衡和T淋巴细胞亚群,对抗原所致免疫性肺损伤具有防护作用,提示其在免疫性疾病的发病和防治中具有一定意义。