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“基因组靶向定位诱导损伤技术”(targeting induced local lesions in genomes TILLING),又称为“TILLING技术”,在研究反向遗传学和定向突变方面是一种全新的方向。其方法的特别之处在于利用化学诱变剂“甲基磺酸乙酷”(Ethylmethane sulfonate,EMS)处理植物种子及愈伤组织,使其产生一系列点突变,将CEL-Ⅰ酶切的高效与化学诱变的高频紧密结合,可快速有效地从突变群体中筛选鉴定出突变体,为作物品种改良提供新颖的种质资源。本研究选用酿酒高粱红缨子作为供试材料,选择0.5%的EMS诱导处理高粱种子8小时,置培养箱中催芽后进行种植。有效结合田间性状表型突变观测,构建突变体库,发现高粱植株株高、叶色叶形、穗型、产量因素、育性以及早衰突变等各个方面存在不同程度的变异,突变性状丰富,为筛选有益突变体奠定了基础;同时,在M1、M2代株系中,对影响高粱赤霉素受体基因GID1进行TILLING分析,以期望获得抗旱突变体,为高粱在抗旱育种方面创制全新的种质资源。1、突变体库的构建及表型分析对高粱植株的M1代突变体的形态变异进行了田间农艺性状调查,结果发现,与对照相比,EMS处理的M1代结实率、成株率和出苗率明显降低;另外,M1、M2变异形态类型较丰富,主要有6种典型表型突变。创建了一系列有益的高粱突变体库,M1代发生表型突变植株共计286株,总频率约为6.61%,其中分蘖突变体最多,有81株,突变频率频率最高,为1.87%;叶片次之,突变植株共计76株,突变频率为1.76%;株高突变体54株,突变频率为1.25%,株高最高达135 cm,最低至45 cm;M1代结实情况与对照相比也相差较大,且出现了植株矮化等有益突变。M2形态变异主要表现在分蘖数、植株株高、育性和早衰突变等性状突变。与M1代相比,其突变类型较少,但是各个类型的突变植株增加,其突变频率较高,突变植株共有59株,突变频率为5.36%。2、抗旱生理指标分析在经EMS诱导处理以后,红缨子高粱的平均株高为73.55,最高可达98 cm,最低仅为59 cm,变异系数分别为0.06和0.13。平均株高与野生型相比显著下降,出现了一定的矮化现象,由于抗旱性强的植株其株高一般不高,因此植株矮化是鉴定农作物抗旱性的重要农艺性状之一,高粱矮化是选育抗旱新品种的重要指标之一。通过田间直接鉴定法发现植株M2-794、M2-333、M2-746的田间抗旱性较强,达到二级水平。通过对红缨子高粱M2代生理指标分析及田间直接鉴定法鉴定高粱植株的抗旱性,发现M2-521、M2-619、M2-665、M2-727、M2-794中脯氨酸Pro含量较高,最高为M2-521达95.8μg/g;M2-746、M2-33、M2-794、M2-574、M2-333中丙二醛含量较高,最高为M2-746达63.7mg/g;而M2-794、M2-333的可溶性糖含量较高,分别为87.2mg/g、88.3mg/g,其中M2-333的脯氨酸含量则相对较低,而其他指标含量则相对较为平均,但抗旱性一般。统计分析发现,突变植株M2-746的脯氨酸含量、丙二醛、可溶性糖含量均显著高于对照,分别为47.7μg/g、63.7nmol/g、49.1mg/g。株高显著低于对照,表现出一定的矮化突变现象,而叶片数量和叶片大小无显著差异。因此,根据脯氨酸、丙二醛、可溶性糖含量等初步判定M2-746植株的抗旱性较强,田间抗旱性达到二级。3、高粱GID1基因生物信息学分析生物信息学分析结果表明,高粱GID1和小米(Setaria italica var)GID1在A亚结构域中只有1个氨基酸的不同,在B亚结构域有4个氨基酸的不同,在D亚结构域有2个氨基酸的不同。高粱GID1与其他植物也存在相似的保守结构域,只有几个氨基酸的差异。经过构建进化树分析,发现高粱赤霉素受体基因GID1与黍(Panicum hallii var.hallii)、玉米(Zea mays)、小米(Setaria italica var)的亲缘关系较近,蛋白质二级、三级结构预测指出,GID1基因编码蛋白的氨基酸序列中α-螺旋为30.6%,延伸链为14.1%,随机卷曲序列为55.3%。由此可推测,α-螺旋和无规则卷曲是GID1蛋白的大量结构元件,而延伸链和β-转角则散布于整个蛋白质中。4、突变位点检测分析通过提取诱变植株M1、M2代的基因组DNA,构建DNA混池。对高粱GID1进行定向PCR扩增,经CEL-Ⅰ酶切及毛细管电泳后,进行TILLING分析。筛选出1个突变植株M2-746,经测序验证,发现有8个碱基突变位点,其中两个在内含子区域,对基因的表达不会造成影响;在180 bp、540bp处分别有1个点突变,在720bp、780bp处分别有两个点突变,120 bp处有3个点突变,突变密度为1/9.44kb。GID1基因第1外显子区域的第558 bp核苷酸,由TCC变化为TC-,其中C碱基发生缺失,引起编码的第186位的丝氨酸发生缺失突变,导致丝氨酸缺失,其相关影响有待于进一步的验证。