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宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中排名第二,平均每10万中国女性中就有98.9的人患病,死亡人数占发病人数的30%左右,并且逐年呈现增长的趋势。宫颈癌的发生是一个长期的过程,90%以上病人经历过高危HPV病毒的持续感染,然后发展成为宫颈癌癌前病变甚至宫颈癌。然而,从癌前病变时期发展到癌变时期的过程需要几年甚至十几年之久,但是癌前病变和早期宫颈癌患者利用子宫颈环电切术、子宫颈管搔刮术的治愈率极高,无生育需求的高龄女性也可以通过经腹子宫全切术达到完全治愈的效果。因此准确性高的早期筛查技术是改善宫颈癌发病率和死亡率的关键。目前对于宫颈癌的早期筛查,一般首先采用巴氏涂片检测(Papanicolaou Test,Pap Test)或新柏氏液基细胞学检测(Thinprep Cytological Test,TCT),对于检查结果呈异常的受检者,将进一步接受阴道镜活检来确认病情。前期我们对这两项检测报告的调查结果为TCT和Pap检测的准确率仅为68.86%,漏诊率高,有极大的可提升空间。虽然HPV检测是宫颈癌筛查的重要补充手段,但约80%女性一生中曾有HPV感染史,仅不到4%患者会持续感染,发展为宫颈上皮内瘤变(CIN)或宫颈癌。HPV检测用于筛查的假阳性高,并且相关检测技术多依赖进口,费用昂贵。因此,迫切需要开发一种更准确的诊断方法,以便在早期发现宫颈癌。外泌体在细胞沟通中发挥着重要的作用,miRNA通常在肿瘤细胞中特异性的表达,反映癌症患者不同的miRNA表达谱。本研究的主要目标是确定循环外泌体miRNA在宫颈癌早期患者中的表达情况,筛选适合的早期诊断生物标志物,改善患者的生存状态。因此,我们结合二代测序技术和分子生物学技术,前期,收集到121份血浆样本,包括93个CINII期以上患者,23个正常志愿者和5个CINI期患者的样本进行外泌体miRNA的二代测序。利用高通量测序数据,比较不同组别之间的miRNA表达谱,找寻各组间有差异的特征miRNA分子。最后,我们筛选出 8 个 miRNAs,分别是 let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-144-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-215-5p 和 miR-4443,其可以将 CINI与正常志愿者组成的CINI-组与CINII期及以上的CINII+组有效地区分开来。我们另收集了 46对宫颈癌病人的癌组织和癌旁组织,利用qRT-PCR的方法对其进行差异miRNA的表达验证,验证出3个miRNAs与测序数据的变化趋势一致且差异显著,分别是let-7d-3p、let-7a-3p、miR-30d-5p,2个miRNAs的变化趋势与测序数据相反且差异显著,分别是miR-144-5p和miR-4443。我们用液滴式数字PCR(ddPCR)在203个独立的血浆样本中验证了 2个miRNAs(miR-30d-5p 和 let-7d-3p)。在 CINI-组和 CINII+组中,miR-30d-5p 和let-7d-3p的表达差异显著(p<0.01),AUC分别为0.79和0.822。两个miRNAs分子联合分类时,ddPCR结果的AUC值可以达到0.828,相较于二代测序数据在两组之间的AUC值-0.922,其结果略有下降,但仍然具有比较好的分类效果。在验证miR-30d-5p时,我们发现miR-30a-5p与其只相差一个碱基。为了检测标志物的稳定性和真实性,我们同时在46对宫颈癌组织样本和203份血浆样本中验证了 miR-30a-5p的表达。其结果发现,用qPCR检测时,miR-30d-5p和miR-30a-5p的表达比较接近,相关系数为r=0.979,而用ddPCR检测时,miR-30a-5p在CINI-和CINII+组中差异不显著,且与miR-30d-5p的ddPCR结果的相关性明显降低(r=0.442)。另外,在外泌体miRNA的ddPCR验证中,我们采用了多内参联合标准化的方法,利用二代测序数据选择了 4个变异系数小于5%,稳定且表达量高的miRNAs 作为内参,分别是 miR-128-3p、miR-129-5p、miR-320a 和 let-7i-5p。我们利用DIANA数据库对8个差异变化的miRNAs,进行了靶向基因的富集通路分析,其中与超过5个miRNAs有显著关联(p<0.01)的通路有25个,包括多个癌症相关的通路,如细胞周期通路、p53信号通路、癌症通路、癌症相关蛋白聚糖通路、AMPK信号通路和癌症转录失调通路等。除此之外,还有一些与癌症相关的妇科疾病通路,如位列第一的病毒致癌通路、细菌侵入上皮细胞通路、HTLV-1病毒感染通路、卵母细胞减数分裂通路等。其中不乏重要的癌症相关基因,如 RAC1、IGF1R、NRAS、TP53、CCND1、CDC27、YWHAG、CDK6 和 MAP3K1。对于 ddPCR 检测的 7 个miRNAs(miR-128-3p、miR-129-5p、miR-320a、let-7i-5p、miR-30a-5p、miR-30d-5p和let-7d-3p),我们发现其在组织和外泌体中呈现了不同的miRNA表达谱,相关系数仅为0.50。该结果极大程度证实了外泌体中的miRNA应该是细胞有选择分泌的产物,并不是随机丢弃的细胞代谢废物。通过以上结果,我们可以得出以下结论:外泌体miR-30d-5p和let-7d-3p能有效区分CINI-和CINII+组的患者;外泌体miRNA可以作为宫颈癌早期诊断的标志物;外泌体极可能带有癌细胞选择性分泌的miRNA,参与到多个肿瘤相关的基因通路当中,进行转录后调控。未来,我们将进行深入的方法优化和扩大样本筛查,挖掘更多的外泌体miRNA标志物,将其运用于宫颈癌的临床早期筛查。