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目的（1）利用TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,肿瘤基因组图谱数据库）,筛选肺腺癌预后相关的甲基化位点。（2）验证TCGA数据库筛选出的甲基化位点对中国肺腺癌病人预后的影响,评估其对肺腺癌病人预后的预测价值。（3）研究前期筛选出的甲基化位点对肺腺癌模式细胞生长状态以及目的基因表达水平的影响,探索这些甲基化位点影响肺腺癌发生发展的生物学机制。方法（1）基于TCGA数据库筛选肺腺癌预后相关甲基化位点:选取TCGA数据库中肺腺癌病人的临床数据、全基因组甲基化数据和转录组测序数据。首先对癌和癌旁组织中全基因组甲基化位点的甲基化水平进行差异性分析,筛选出癌和癌旁组织中甲基化水平差异显著的甲基化位点,进而采用LASSO COX（Least absolute shrinkage and selection operator COX）回归分析从中筛选出与肺腺癌预后相关的甲基化位点组合（即甲基化signature）,通过甲基化signature结合临床数据构建肺腺癌病人预后预测模型。运用Harrell’s C统计量对该模型的预测效果进行评估。同时,采用相关分析研究甲基化位点甲基化水平与相应基因mRNA表达水平之间的相关性。（2）肺腺癌预后相关甲基化位点对中国肺腺癌人群预后的影响:对TCGA数据库中筛选出的肺腺癌预后相关甲基化位点在中国肺腺癌病人中进行验证。研究对象为2014年1月1日-12月31日于武汉同济医院行手术治疗且病理诊断明确的肺腺癌病人,收集病人的肿瘤组织和癌旁组织样本。采用焦磷酸测序检测肺腺癌组织中各甲基化位点的甲基化水平,运用COX回归分析甲基化signature与肺腺癌预后之间的关系,Harrell’s C统计量评估预测模型对肺腺癌预后的预测效果。同时采用实时荧光定量PCR（Reverse transcription-PCR,RT-PCR）检测甲基化位点所在基因mRNA表达水平,Western blot检测甲基化位点所在基因的蛋白表达水平,采用相关分析检验甲基化位点甲基化水平与相应基因mRNA表达水平之间的相关性。（3）肺腺癌预后相关甲基化位点对肺腺癌模式细胞功能的影响:体外培养人肺腺癌A549细胞、NCI-H1975细胞和人胚肺MRC-5细胞,并经不同浓度的5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine,5-aza-2dC）去甲基化处理（0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）。MTT实验检测细胞生长状态,焦磷酸测序检测不同5-aza-2dC浓度处理后细胞中各甲基化位点的甲基化水平,RT-PCR和Western blot检测不同5-aza-2dC浓度处理后各甲基化位点所在基因mRNA水平和蛋白表达水平。结果（1）基于TCGA数据库筛选肺腺癌预后相关甲基化位点:共纳入TCGA数据库中418例同时具有临床预后信息和全基因组甲基化信息的肺腺癌病人。其中26例病人同时有癌组织和癌旁组织的全基因组甲基化水平数据。经过筛选,在肿瘤组织和癌旁组织中有1291个甲基化位点甲基化水平差异显著（FDR<0.05且|log2（fold change）|>2.5）。采用LASSO COX回归从这些甲基化位点中筛选肺腺癌预后相关的甲基化位点,最终筛选出三个甲基化位点cg14517217,cg15386964和cg18878992,同时构建三个位点组成的甲基化位点组合即甲基化signature。采用COX回归调整年龄、性别、种族、吸烟情况、放化疗情况和病理分期等变量后发现,随着甲基化signature水平的增加,肺腺癌病人的死亡风险逐渐升高（HR=45.30,95%CI=6.69-306.83;P<0.001）。根据甲基化signature水平的中位数将人群分为高风险组和低风险组,结果显示与低风险组肺腺癌病人相比,高风险组病人的死亡风险增加123%（HR=2.23,95%CI=1.41-3.54;P<0.001）。采用甲基化signature对肺腺癌预后进行预测时Harrell’s C统计量结果为0.66;当加入年龄、性别、种族、吸烟情况、放化疗情况和病理分期等变量构建预后预测模型后,C统计量增加至0.77。同时,三个甲基化位点（cg14517217、cg15386964、cg18878992）的甲基化水平与所在基因（SEPT9、HIST1H2BH、MAPT）mRNA表达水平之间的相关性均具有统计学意义（相关系数分别为0.32、0.71和-0.35,P值均<0.001）。（2）肺腺癌预后相关甲基化位点对中国肺腺癌人群预后的影响:共纳入116例肺腺癌病人。COX回归结果显示,当调整了年龄、性别、吸烟情况、放化疗情况和病理分期等变量后,随着甲基化signature水平的增加,肺腺癌病人的死亡风险度逐渐升高（HR=8.81,95%CI:2.72-28.51;P<0.001）,且与低风险组肺腺癌病人相比,高风险组病人的死亡风险增加7.52倍（HR=8.52,95%CI:0.52-138.58;P=0.132）。采用甲基化signature进行肺腺癌病人预后状况评估时,C统计量为0.61;当采用预测模型进行预后评估时,C统计量增加至0.73。比较30例中国肺腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中cg14517217、cg15386964、cg18878992的甲基化水平结果显示,肿瘤组织中各位点的甲基化水平均高于癌旁组织（P值均小于0.05）。30例肺腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织甲基化位点的甲基化水平与相应基因表达水平的相关性分析显示,甲基化位点cg14517217、cg15386964和cg18878992的甲基化水平与其所在基因（SEPT9、HIST1H2BH、MAPT）mRNA表达水平之间的相关系数分别为0.31（P=0.095）、0.41（P=0.024）和-0.28（P=0.138）。（3）肺腺癌预后相关甲基化位点对肺腺癌模式细胞功能的影响:MTT实验结果显示,经5-aza-2dC处理后细胞的生长状态均受到抑制,且对A549和NCI-H1975细胞的抑制现象更明显。焦磷酸测序结果显示,自然状态的MRC-5细胞表现出低甲基化状态,细胞A549和NCI-H1975呈现高甲基化状态。5-aza-2dC处理对MRC-5细胞的甲基化水平影响不大,而使A549细胞和NCI-H1975细胞的甲基化水平降低。MRC-5细胞经过不同5-aza-2dC浓度处理后的三个甲基化位点所在基因的mRNA和蛋白表达水平无显著变化。经5-aza-2dC处理后细胞A549和NCI-H1975中甲基化位点cg14517217、cg15386964所在基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平下调,cg18878992所在基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平上调。结论（1）经TCGA数据库挖掘,筛选出的甲基化位点cg14517217、cg15386964和cg18878992与肺腺癌病人的预后有关,且通过甲基化signature和相关临床变量构建的预测模型能够较好的预测中国肺腺癌病人的预后。（2）通过模式细胞对甲基化相关机制研究的结果显示,筛选出的甲基化位点甲基化水平的改变可能影响基因SEPT9,HIST1H2BH和MAPT的mRNA和蛋白表达水平。甲基化位点对肺腺癌预后的作用可能是通过改变相关功能基因的表达情况,进而对肺腺癌的发生发展产生影响。