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猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是猪地方性肺炎（Swine EnzooticPneumonia,SEP）（亦称猪气喘病）的病原体。此病分布广,发病率高,自身致死率不高。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而继发其他致病菌的感染,提高致死率。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在疾病控制方面至今未能达到满意的效果。本实验以Mhp168株为材料,研制出其特异性单克隆抗体,并利用Mhp的全菌蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,且证明有一定的实用性。 首先用KM2培养基（含马血清）培养Mhp168F323株。高速离心,用PBS悬浮沉淀。悬浮物反复冻融并超声波裂解后作为抗原,与等量完全弗氏佐剂（第一次）、不完全佐剂（第二次）混合后皮下及腹腔注射免疫8周龄BALB/c小鼠（200μg/只）,间隔时间3周。加强免疫3天后,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合,并用间接ELISA方法进行筛选。初步鉴定为阳性的细胞克隆,采用有限稀释法进行3次亚克隆后,得到2株分泌特异性抗体的单克隆细胞株。生物学特性鉴定表明,腹水单抗的间接ELISA效价在1:104左右,免疫球蛋白亚类均为IgG3。免疫印记结果表明,单抗所针对的抗原表位分别在70KD和40KD左右,而且不与马血清蛋白反应,说明以上单抗是针对Mhp蛋白的单抗。用猪肺炎支原体Mhp168株培养物,制备抗原,建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法,试验的最佳反应条件为:抗原的包被浓度为1.5μg/ml,待检血清的最佳稀释度为1:100,酶标抗体为1:10000稀释;包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,2%的明胶作封闭液,洗涤液和稀释液均为含0.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液;抗原抗体最佳结合时间为90min,酶标抗体最佳作用时间为60min.使用单抗阻断ELISA方法对血清样品进行了检测并与建立的间接ELISA方法进行了对比,发现单抗阻断ELISA方法对早期感染的猪气喘病病料具有较好的检出率。