[研究背景]骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常见的影响儿童和年轻人的主要恶性骨肿瘤。它是间充质来源的肿瘤并且主要影响长骨,但也可能累及体内其他骨骼。中国的OS患者大约占国内所有恶性肿瘤患者的百分之零点二,比例大约为一百万分之三。虽然尽管目前的医疗方法已经提高了OS患者的5年生存率,但是仍没有达到满意的效果,并且关于OS的病因、细胞生物学行为、治疗和评价方法仍存在许多问题值得深入研究。OS主要发生在生长速度较快的骨组织中,青春期是OS的高发阶段,可能与处于青春期的骨组织生长较快有关。骨肉瘤表现为好发于长骨的干骨后端,最常见于股骨远端(43%)、胫骨近端(23%)或肱骨(10%)。典型的症状包括骨疼痛和肿胀发作,并且程度足以使患者无法入睡。OS患者的疼痛与生长的疼痛相似,但是前者恶性程度更高。OS不但容易复发,并且在早期发生转移概率较高。在大多数的OS患者中,为防止肿瘤转移至全身,通常在手术前或者手术后进行化疗或者放疗,但是目前采用的标准疗法对于改进治疗以及改善预后收效甚微。因此开发综合和多维治疗OS的方法是非常必要的。目前,病毒载体、基因治疗法、免疫治疗法、抗血管生成治疗法和促细胞凋亡治疗法已经被用于OS患者中。长链非编码 RNA(long non-noding RNA,lncRNA)长度约200个核苷酸,不能编码蛋白质。此外,它具有广泛的多样性,被发现能够参与调节多种生物过程。lncRNA的种类、数量以及作用模式都比较多,lncRNA 能够分为正义lncRNA(sense lncRNA)、反义 lncRNA(antisense lncRNA)、基因内 lncRNA(intronic lncRNA)、基因间 lncRNA(intergenic lncRNA)以及双向 lncRNA(bidirectional lncRNA)。近几年来研究发现 lncRNA能够参与调节细胞生长、增殖以及分化,调控细胞周期和细胞程序性死亡,影响肿瘤的发展和转移包括结肠癌、乳腺癌、肝癌和骨肉瘤等。前期研究发现,lncRNA Sox4(lncSox4)在肝肿瘤初始细胞(tumour-initiating cell,TIC)中充当重要的调节因子,它可以激活Sox4从而促进细胞进行自我更新,但是LncSox4在恶性OS中的作用往往会被忽略。[研究目的]本研究旨在研究lncSox4在OS中的作用。首先,对OS细胞和组织中lncSox4的表达水平进行检测,其次,探究lncSox4对Mg63增殖和迁移的产生的效应,最后,通过研究lncSox4对Wnt/β-catenin信号传导途径产生的效应探究lncSox4在OS细胞中的功能机制。[研究方法]第一部分:为研究lncSox4在OS中的表达水平,我们选取OS细胞U-20S,Mg63 以及 OS 组织 Tumor sample#1、Tumor sample#2 作为研究对象,通过实时定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分别检测了 OS细胞和组织中lncSox4的表达情况;此外还利用Northern blot检测两种OS细胞中lncSox4的表达水平。第二部分:为研究lncSox4表达异常对肿瘤细胞增殖和迁移的影响,首先利用细胞转染技术分别将silncSox4 1#、silncSox4 2#、oelncSox4以及对照转染到OS细胞Mg63中,qRT-PCR检测细胞中lncSox4的表达情况;然后利用流式细胞仪检测在lncSox4过表达或敲低的细胞中Ki-67+指数;分别通过四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和Transwell检测法对细胞的活力和迁移能力进行测定。第三部分:为进一步解析lncSox4在OS中的作用机制,首先,利用qRT-PCR检测lncSox4与细胞中Sox4是否存在调控关系,此外,还对细胞中肿瘤相关因子GLI1、GLI3、TCF1、CCND1、MYC1、HES1和HEY1的表达水平进行检测;随后,用5μM环己酰亚胺分别处理转染silncSox4的细胞和对照细胞,处理时间为0 h、4 h、8 h和24 h。利用Western blot对两种细胞中的β-catenin的蛋白水平进行测定,同样采用环己酰亚胺分别处理转染oelncSox4的细胞和对照细胞,处理时间为0 h、12 h、24 h和36 h,Western blot测定两种细胞中的β-catenin的蛋白表达情况,此外,还利用RNA pull-down进一步确定lncSox4与p-catenin的作用关系:最后分别向lncSox4下调的细胞中加入500 nM Wnt兴奋剂CID11210285,向lncSox4上调的细胞中加入1μM Wnt抑制剂IWP-3,并利用MTT法对细胞活力进行检测。[研究结果]第一部分:qRT-PCR检测,结果表明,与对照组细胞293T相比,在U-20S细胞和Mg63细胞中,lncSox4的表达水平均出现显著上调(P<0.001),此外,利用 Northern blot 对 U-20S、Mg63 和 293T 细胞中LncSox4的表达情况进行检测,检测结果与mRNA水平检测结果基本一致,在U-20S和Mg63细胞中lncSox4的表达水平均比对照细胞 293T的表达水平要高。而在两组OS组织 Tumor sample#1和Tumor sample#2,分别对两个组织中的lncSox4表达水平进行检测发现,与正常组织相比,在OS组织Tumor sample#1和Tumor sample#2,lncSox4的表达也都显著增加(P<0.001)。第二部分:qRT-PCR检测,结果表明,当分别转染 silncSox4 1#和silncSox4 2#后,细胞中lncSox4的表达水平均被降低(P<0.001),转染oelncSox4后,lncSox4的表达水平被上调(P<0.01):流式细胞测定,结果表明,在转染silncSox4 1#和silncSox4 2#的细胞中,Ki-67+细胞的数量均显著降低(P<0.001),而在过表达lncSox4的细胞中,Ki-67+细胞的数量显著增加(P<0.01);MTT法检测细胞活力结果表明,培养4天后,在转染silncSox4 1#和silncSox4 2#的细胞中,与对照组相比,细胞的活力均显著降低(P<0.001),在转染oelncSox4的细胞中,与相应的组比较,细胞活力增强(P<0.001);Transwell法检测,结果表明,lncSox4表达降低使细胞的迁移能力减弱(P<0.01),而lncSox4高表达使细胞的迁移能力增强(P<0.01)。第三部分:qRT-PCR检测,结果表明,在lncSox4表达上调或下调的细胞中,Sox4的表达水平与对照细胞相比并没有显著差异,此外,对转染后细胞和对照细胞中肿瘤相关因子的表达水平进行检测,结果发现,在7种肿瘤相关因子中,只有TDF1和CCND1的表达水平发生变化,在下调lncSox4的细胞中,与对照组相比,TCF1和CCND1的mRNA表达水平都出现了显著下调(P<0.001或P<0.01),而在上调lncSox4的细胞中,与对照组相比,TCF1和CCND1的mRNA表达水平都出现了显著上调(P<0.0 1),Western blot与qRT-PCR的测定结果基本相同,在转染silncSox4的细胞中,TCF1和CCNDI的蛋白表达水平均降低,而在转染oelncSox4的细胞中,TCF1和CCND1的蛋白表达水平均出现增加;在用环己酰亚胺处理silncSox4组细胞和对照组细胞24 h后,在对照组细胞中,β-catenin的蛋白表达很少,而silncSox4 的细胞中β-catenin蛋白几乎被完全降解,在用环己酰亚胺处理oelncSox4组细胞和对照组细胞,当培养36 h后,转染oelncSox4细胞中β-catenin的蛋白表达要高于对照组细胞。RNA pull-down实验也进一步证实lncSox4能够与β-catenin进行结合;最后,对于细胞活力,与对照组细胞silncSox4+vehicle组相比,添加Wnt兴奋剂CID11210285后,细胞活力显著增加(P<0.01),而当培养到第4天时,细胞活力达到最大;同样在添加Wnt抑制剂IWP3后,与对照组细胞oelncSox4+vehicle组相比,,在培养到第2天、第3天和第4天时,细胞活力均出现显著下降(P<0.01或P<0.001)。[研究结论]通过本研究,发现无论是在OS细胞U-20S和Mg63,还是在OS组织中,lncSox4均发生过表达,并且lncSox4的沉默能够降低Ki-67+细胞的数量,抑制细胞的活力和迁移能力,而当在细胞中过表达lncSox4时,则出现相反的效果,在OS细胞中,lncSox4能够与β-catenin作用,并激活Wnt/β-catenin信号传导通路。在OS中,lncSox4提高了细胞的增殖和迁移,这可能是通过激活Wnt/β-catenin通路来实现的。本研究可能为OS的诊断、治疗或预后提供了良好的视点。