DNA测序技术是进一步研究和改造目的基因的基础,是现代生物学研究中重要的手段之一,在生命科学等领域有着广泛应用。本论文基于不同类型的核苷酸参与合成反应产生相同检测分子的原理,提出一种两核苷酸实时合成测序新技术,为高通量DNA实时合成测序提供一种增加DNA测序阅读长度的策略；同时也为PCR产物的实时分析提供一种新方法。本论文的主要研究内容和成果如下：1.两核苷酸实时合成测序技术的原理及特征与传统焦磷酸测序技术(简称焦测序技术)不同,该测序技术不是直接读取具体的碱基信息,而是通过解码序列的编码信息来确定待测序列,这些编码包含参与合成反应的核苷酸类型和数目。首先,从理论上探讨该测序技术的可行性；A、G、C和T四种碱基,能形成六种不同的两核苷酸组合：AG、AC、AT、GT、CT和CG,这六种不同的两核苷酸组合能形成三组两核苜酸测序循环加入方式(AG/CT、AC/GT和AT/CG)。对任意一条待测序列而言,从三组测序方式(AG/CT、AC/GT和AT/CG)中任选两组进行两次平行合成测序,得到两组编码序列片段,再按照既定的解码原理组装出待测DNA模板的准确碱基信息,表明该测序策略的可行性。其次,从实验的角度出发,利用焦磷酸测序平台(Pyrosequencing PSQ 96MATM system, Biotage)验证了该测序技术的可行性；通过对同一条已知序列的模板进行两次平行测序得到两组编码序列,解码这两组编码序列最终得到的序列与待测DNA序列完全一致。第三,对两核苷酸合成焦测序技术进行了条件优化：(1)该技术中能实现合成反应的DNA模板量为0.3～5 pmol;(2)当均聚物片段长度≤7 bp时,两核苷酸实时合成测序技术中合成碱基数目与信号强度成正比；(3)当待测模板含有均聚物片段时,模板量≤1 pmol时能成功测定≤7 bp的均聚物片段；(4)该技术中最佳dNTPs的量应该≤250 pmol。最后,从理论上探讨了该技术用于高通量DNA测序技术的特征、连锁解码错误的应对策略以及均聚片段测序信息或者类均聚物片段的应对策略,为高通量DNA实时合成测序提供一条增加DNA测序阅读长度新策略。2.两核苷酸合成焦测序技术对PCR产物的定性分析研究从理论上探讨两核苷酸合成焦测序的一次循环测序用于PCR产物定性分析的可行性。基于两核苷酸实时合成焦测序对PCR产物“峰型识别”的原理,利用单次焦测序所得的编码信息定性分析PCR产物。首先,将该技术应用于微生物种群分离鉴定中；通过单次测定四种链球菌菌株S. infantis、S. peroris、S. anginosus和S.constellatus的rnpB基因中可变区P3区序列,得到一组两核苷酸碱基编码。根据特定序列在特定的测序方式下能得到特定的峰型或者编码数目的特点,对比编码长度和每次合成反应产生的信号强度,准确地分离了传统焦测序技术很难鉴定的这四种链球菌菌株。相对传统焦测序中峰信号差异几乎为零的序列,在两核苷酸实时合成测序所得的编码中显示的差异为14%,表明该分析技术能放大相似序列之间的差异以及准确鉴定传统焦测序技术很难鉴定的菌株的特征,为微生物菌株的鉴定提供了有效的途径。其次,将该技术应用于同时分型同一DNA模板中多个SNP位点；在UGTIAI (uridine diphosphoglucuronosyl transferase 1A1,尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1)基因上的3个不同片段中,选取间隔分别为37 bp的2个SNP、58 bp的3个SNPs以及82 bp的3个SNPs,从六种不同两核苷酸加入方式(AG、AC、AT、GT、CT和CG)中选择特异的加入方式到合成反应中,避免SNP位点后的序列的不同步延伸,最终成功分型了这一系列位点。该分析方法克服了传统焦测序技术只能同时鉴定25 bp内至多3个SNPs的缺点,为同时分型多个SNP位点提供一种有效、快捷的方法。与此同时,利用两核苷酸实时合成测序增强测序信号的特性,通过研究不同模板含量的两核苷酸实时合成测序,成功鉴定了每微升含50个DNA拷贝数的样本中的等位基因。3.两核苷酸合成焦测序技术对PCR产物的定量分析研究两核苷酸实时合成焦测序中,合成反应所得的信号强度与插入到核苷酸序列中的dNTPs的量成正比,而参与合成的dNTPs的量与DNA模板量成正比。据此原理,本论文进一步研究了该技术对PCR产物的定量分析。首先,通过两核苷酸实时合成测序测定一系列1.5倍或者2倍梯度稀释的样本,建立了位点rs6717546和rs4148324的浓度-信号标准曲线,并从所建立的浓度-信号标准曲线得出测序模板浓度的线性范围,对线性范围内核苷酸合成反应产生的信号强度与参与反应的模板浓度之间的定量关系线性拟合,建立线性范围内核苷酸合成反应产生的信号强度与参与反应的模板浓度之间的线性标准方程。通过测定标准品中纯合型和杂合型的预期比例分别为0%、10%、20%...100%的样本,将SNP处标准化后的测序信号代入线性标准方程进行求解,得出实测标准品纯合型和杂合型的比例,这些实测比例与期望比例值呈高度相关性(R2均大于0.95)。其次,利用标准线性方程准确分析了24个样本中位点rs6717546和rs4148324的等位基因频率,并将基于两核苷酸实时合成测序标准方程计算的等位基因频率与传统焦测序技术等位基因定量模式所得的频率进行比较。结果发现两者之间并没有显著差异(P>0.05)。最后,利用纯合型和杂合型预期比例分别为1%、3%、5%和7%的样本,确定了该技术的检测限为3%,优于传统焦测序技术的5%。