【背景】糖尿病足部溃疡是临床上常见的糖尿病慢性并发症,常导致创面难愈合,是导致截肢的主要原因之一,不仅给患者造成巨大的精神压力,严重影响生活质量,同时还造成沉重的社会经济负担。据统计,糖尿病患者足部溃疡的发病率为4%—10%。随着糖尿病发病率的迅速上升,这一并发症将呈明显增多的趋势。深入研究糖尿病足部溃疡创面难愈合的机制,寻找新的预防和治疗方法是当今的一项重要课题。皮肤的创面愈合是一个复杂却有序的生物过程,在每个时期都有许多组织、细胞外基质、细胞因子等参与,涉及一系列的生物学过程,如:出血、血管反应、炎症反应、肉芽组织形成、再上皮化及修复后的重塑等。巨噬细胞是创面修复的重要参与者。巨噬细胞不但具有吞噬和清除异物、坏死组织的功能,而且能分泌多种细胞因子参与修复。Shirafuji等发现:巨噬细胞浸润受阻是手术后病人伤口愈合延迟的一个重要原因。当巨噬细胞分泌功能障碍可能导致炎症反应不足,从而影响创面修复的进程。研究显示:皮肤组织中,巨噬细胞是分泌血管内皮生长因子C(VEGFC)的主要细胞之一。在糖尿病期间,局部的高糖环境可以导致巨噬细胞的功能损伤。当巨噬细胞不能活化或者数量减少时,局部组织中VEGFC减少,可能影响到创面炎症期和修复期的淋巴管的形成。淋巴管形成的激活受多种细胞因子的调控,涉及一系列的连续而有序的步骤,这些步骤和血管内皮细胞增殖、出芽生成不同,淋巴管内皮是以单个细胞移行,然后连接成管型结构的。淋巴管内皮的增殖受多种因子和因素的调节,主要分为正向调节因素和负向调节因素。正向调节因素主要有:VEGF家族、肝细胞生长因子(HGF)家族和表皮生长因子(EGF)。肿瘤坏死因子α(TNF-α)为负向调节因素。VEGF是一种肝素结合型糖蛋白,是一种特异性的作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子。VEGFC是VEGF家族的重要成员,可以通过和血管内皮上的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)以及淋巴管内皮上的血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)结合,引起血管和淋巴管的增殖。VEGFC和VEGFR3的结合能力远高于VEGFC和VEGFR2的结合能力,所以VEGFC对淋巴管的影响比对血管的影响可能更为重要。VEGFC与淋巴管内皮细胞的特异性受体VEGFR3结合,激发内皮细胞迁移、增殖和管腔形成等淋巴管新生过程,发挥其促淋巴管生成的作用。有研究发现皮肤淋巴管在创面炎症反应阶段可以向反应区域运输树突状细胞等,说明皮肤淋巴管除了局部引流、清除反应产物等作用外,还是炎症反应的参与者。也有研究显示:在糖尿病db/db小鼠皮肤溃疡组织中,分泌VEGFC的巨噬细胞数量和活力明显降低,并由此导致淋巴管的形成减少,最终引起糖尿病小鼠溃疡难愈合。研究者使用白细胞介素1β(IL-1β)处理小鼠骨髓的巨噬细胞后,巨噬细胞的分泌活性明显得到恢复,使用这种恢复功能的巨噬细胞处理db/db小鼠创面,可以见到创面愈合速度明显加快,通过激光共聚焦显微镜检测出淋巴管的形成增加。由此推断:在糖尿病发病过程中,皮肤组织中的巨噬细胞数量和功能降低,导致局部的VEGFC生成减少,不能形成足够的淋巴管,从而导致了创面炎症反应不足和愈合延迟。临床上我们发现有的患者创面血液供应充分,检测踝臂指数(ABI)＞0.7,未见明显的感染,创面愈合依然非常缓慢。是否由于糖尿病患者皮肤组织中的巨噬细胞功能降低,导致局部的VEGFC生成减少,不能形成足够的淋巴管,从而导致了创面炎症反应不足和愈合延迟?高血糖和/或糖基化终末产物(AGE)是否可以导致巨噬细胞分泌VEGFC的功能降低,是否可以导致巨噬细胞吞噬功能降低,从而导致创面炎症反应不足和愈合延迟?基于已有的研究结果及对上述问题的思考,我们选取糖尿病足部非缺血性溃疡皮肤、非糖尿病足部溃疡皮肤、正常皮肤组织为研究对象,应用RT-PCR和免疫组化的方法,检测三组皮肤组织VEGFC mRNA和蛋白的表达水平,从分子生物学技术水平探讨VEGFC在糖尿病足部非缺血性溃疡难愈合的作用机制。并研究U937细胞经不同浓度的葡萄糖、AGE及葡萄糖和AGE联合刺激培养不同时间后,U937细胞VEGFC基础分泌量和吞噬能力的改变,为进一步预防和治疗糖尿病足部非缺血性溃疡提供新的实验依据。研究分为以下两部分进行:第一部分VEGFC在糖尿病足部非缺血性溃疡皮肤组织中表达的研究【目的】观察VEGFC在糖尿病足部非缺血性溃疡皮肤组织中的表达并与正常皮肤组织和非糖尿病足部溃疡皮肤进行比较,探讨VEGFC在糖尿病足部非缺血性溃疡难愈合的作用机制。【方法】1.以糖尿病足部非缺血性溃疡皮肤组织(DF组)为研究对象,非糖尿病足部溃疡皮肤组织(NDF组)和正常皮肤组织(NC组)为对照。2.记录提供标本的患者的年龄、糖尿病史和溃疡形成时间。3.RT-PCR法检测三组皮肤VEGFC mRNA的表达。4.免疫组织化学方法检测三组皮肤VEGFC蛋白的定位和表达。5.使用SPSS13.0软件处理所有数据并进行统计学分析;实验数据均采用计量资料,以均数±标准差((?)±s)表示,三组之间数据采用one-way ANOVA进行统计学分析,方差不齐的采用对数转换后进行分析或者采用非参数检验;设检验水准α=0.05。【结果】1.三组平均年龄比较无显著性差异(P＞0.05),DF组与NDF组的溃疡形成时间比较无显著性差异(P＞0.05)。2.与NC组比较,DF组VEGFC mRNA表达显著减少(P＜0.001),NDF组VEGFCmRNA表达显著增加(P＜0.001)。3.与NC组比较,DF组VEGFC蛋白表达显著减少(P＜0.001),NDF组VEGFC蛋白表达显著增加(P＜0.001)。【结论】糖尿病足部非缺血性溃疡皮肤组织VEGFC mRNA和蛋白表达减少,可能是导致局部皮肤中的淋巴管形成障碍,从而引起糖尿病足部非缺血性溃疡炎症反应不足、创面修复受损的原因之一。第二部分高糖或/和AGE对U937细胞功能影响的研究【目的】观察U937细胞经葡萄糖或/和AGE刺激后,VEGFC的基础分泌量和吞噬功能,与正常细胞进行比较,探讨葡萄糖或/和AGE对U937细胞分泌VEGFC的功能和吞噬功能的影响。【方法】1.以U937细胞为研究对象,根据预实验结果:葡萄糖的最佳刺激浓度为15mM,AGE浓度的最佳刺激浓度为25μg/ml,最佳刺激时间均为24h,将实验分为以下四组:15mM葡萄糖组(GLU组)、25μg╱ml AGE组(AGE组)、联合培养组(CC组)、正常对照组(NC组)。2.台盼兰染色试验检测各组细胞活力。3.RT-PCR法检测各组细胞VEGFC mRNA的表达。4.免疫荧光化学染色法检测各组细胞VEGFC蛋白的表达。5.墨汁吞噬实验检测各组细胞吞噬能力。6.使用SPSS13.0软件处理所有数据并进行统计学分析;实验数据均采用计量资料,以均数±标准差((?)±s)表示,多组之间数据采用one-way ANOVA进行统计学分析,方差不齐的采用对数转换后进行分析或者采用非参数检验;设检验水准α=0.05。【结果】1.台盼兰染色试验结果显示各组细胞活力比较,无显著性差异(P＞0.05)。2.RT-PCR法检测结果显示NC组细胞VEGFC mRNA表达最高,AGE组VEGFCmRNA表达显著减少(P＜0.05),GLU组、CC组VEGFC mRNA表达显著减少(P＜0.001)。CC组和GLU组比较,VEGFC mRNA表达显著减少(P＜0.05),CC组和AGE组比较,VEGFC mRNA表达显著减少(P＜0.001)。3.免疫荧光化学染色法检测结果显示NC组细胞VEGFC蛋白表达最高,GLU组、AGE组和CC组VEGFC蛋白表达显著减少(P＜0.001),CC组和GLU组、AGE组比较,VEGFC蛋白表达显著减少(P＜0.001)。4.墨汁吞噬实验结果显示NC组细胞吞噬能力最高,AGE组吞噬能力显著降低(P＜0.05),GLU组吞噬能力显著降低(P＜0.01),CC组吞噬能力显著降低(P＜0.001)。CC组和GLU组比较,吞噬能力显著降低(P＜0.05),CC组和AGE组比较,吞噬能力显著降低(P＜0.01)。【结论】1.高糖、AGE刺激及葡萄糖和AGE联合刺激可使U937细胞VEGFC mRNA和蛋白表达减少。高糖和AGE刺激可能是糖尿病患者皮肤组织中VEGFC表达减少的重要原因之一。2.高糖、AGE刺激及葡萄糖和AGE联合刺激可使U937细胞吞噬能力下降。高糖和AGE刺激可能是导致糖尿病足部炎症反应不足,从而引起糖尿病足部非缺血性溃疡难愈合的原因之一。