人类免疫缺陷病毒(HIV),是一种感染人类免疫细胞的慢病毒,能够导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的发生,严重威胁人类的健康。自从1983年发现HIV以来,研究人员从未停止对HIV的研究,但仍没有有效的疫苗上市。本论文共分为两部分,都是基于HIV-1广谱中和抗体展开的疫苗研究。在本论文的第一部分中,我们以诱导广谱中和抗体的产生为目标。选取识别HIV-1包膜蛋白gp41上高度保守的近膜外区(MPER)的10E8广谱中和抗体为研究对象。利用匙孔蓝蛋白(KLH)、多抗原分支肽系统(MAP)以及诺如病毒P颗粒(No V PP)为载体来增强10E8表位的免疫原性,尝试在体内诱导HIV-1 MPER特异性广谱中和抗体。研究结果表明,利用三种不同载体制备的免疫原都有很好的免疫原性,都能够在豚鼠体内诱导产生较高的MPER特异性结合抗体。但非常遗憾的是,三种免疫原诱导产生的广谱中和抗体的中和活性却很微弱。回顾HIV-1疫苗的研发历史,旨在诱导HIV-1广谱中和抗体的疫苗研究始终没有突破性进展。故在本研究的第二部分中,我们转换思路,利用重组腺相关病毒为载体来介导HIV-1广谱中和抗体的长期表达。研究选用了针对HIV-1包膜蛋白gp41 MPER的10E8抗体和针对gp120的NIH45-46抗体进行表达。我们首先在细胞水平上确认了抗体表达的可行性与表达抗体的中和活性,随后利用重组腺相关病毒对Balb/c小鼠进行了免疫。免疫结果显示,重组腺相关病毒能够在小鼠体内稳定表达HIV-1广谱中和抗体,并且抗体在体内的表达时间长达一年。假病毒中和实验结果表明,免疫后小鼠的血清具有较好的中和活性。此外,本研究首次尝试了表达不同抗体的重组腺相关病毒联用的免疫策略,该策略能够增强小鼠血清的中和能力。因此,这种联合免疫的策略可能是有潜力的HIV-1疫苗形式。第一部分:HIV-1 MPER表位免疫原的免疫原性研究自HIV-1发现以来,无数科研人员在研发HIV-1疫苗的过程中付出了巨大的努力,但均未获得理想的结果。而HIV-1精英控制者体内广谱中和抗体的发现,为HIV-1疫苗的研发带来了希望。利用不同免疫原诱导机体产生广谱中和抗体的免疫策略成为科研人员研究的热点。10E8抗体,其识别位点为gp41 MPER上的一段序列,具有广谱性强,中和能力好,无自身反应性等特点。因此,本研究旨在设计不同免疫原在体内诱导产生类10E8样广谱中和抗体。由于10E8表位较短,免疫原性较差,在本研究中,我们选用了KLH,MAP,No V PP三种不同的载体来提高10E8表位的免疫原性。No V PP是一种由24个P结构域组成的亚病毒纳米颗粒,P结构域表面有三个环状结构域(loop1、loop2、loop3),适合外源表位的插入。我们将三拷贝的10E8表位插入到loop2上,以及将单拷贝的10E8表位同时插入到loop1,2,3上,设计了两种以No V PP为载体的重组蛋白免疫原。因此,本论文共设计四种免疫原:10E8-KLH,10E8-MAP4,10E8-loop123 PP和10E8-3loop2 PP。我们对四种免疫原进行了性质表征后,利用豚鼠进行了免疫实验,以期诱导广谱中和抗体的产生。研究结果表明:四种免疫原均能诱导豚鼠体内产生MPER特异性的结合抗体,抗体效价可达1×104-5。值得一提的是,在诺如P结构域的三个环上同时插入表位的10E8-loop123 PP与仅在loop2上插入表位的10E8-3loop2 PP相比,具有更强的免疫原性。然而遗憾的是,随后的假病毒中和实验结果显示,免疫后的血清仅能产生微弱的中和能力,本研究未能利用四种免疫原诱导出有效的广谱中和抗体。由于HIV-1具有高度变异性等特点,以主动免疫的形式很难诱导机体产生广谱中和抗体。这样的结果提示我们需要转换思路,找到使体内产生广谱中和抗体的新策略。第二部分:AAV8介导HIV-1广谱中和抗体表达的研究通过基因载体将目的片段导入到靶细胞并进行成功表达是基因治疗的目的。常用的基因载体包括病毒性载体和非病毒性载体。由于非病毒载体缺乏靶向性、转染效率较低等缺点,所以病毒性载体成为最常用的基因载体。常见的病毒性载体包括腺病毒载体,腺相关病毒载体,逆转录病毒载体等。其中由于腺相关病毒能够介导外源基因的长期表达,使其成为了最有前景的基因治疗载体。本论文选用在人类中具有较少预存免疫的稀有型8型腺相关病毒(AAV8)作为载体来介导HIV-1广谱中和抗体的表达。由于gp120上的CD4结合位点(CD4bs)和gp41的MPER在HIV-1感染T细胞的过程中有着非常重要的作用,我们利用AAV8为载体对识别gp120上CD4bs的NIH45-46广谱中和抗体以及识别gp41 MPER的10E8广谱中和抗体进行表达。本研究分别利用CAG和CMV两种不同的启动子启动AAV8介导的HIV-1广谱中和抗体的表达。我们首先成功构建并包装纯化了四种重组腺相关病毒:CAG-10E8,CAG-NIH,CMV-10E8,CMV-NIH,并通过电泳和透射电镜对纯化后的重组腺相关病毒进行纯度检测。随后,在细胞水平上检测了抗体的表达情况。结果显示抗体能够成功的进行表达,并具有中和活性。我们利用四种重组腺相关病毒对Balb/c小鼠进行了免疫,并首次尝试了不同重组腺相关病毒联合免疫的策略。我们通过ELISA对Balb/c小鼠血清中含有的10E8/NIH45-46抗体的浓度进行了确定。ELISA检测结果表明:四种重组腺相关病毒都能够很好的在小鼠体内介导广谱中和抗体的表达,抗体表达时间长达一年。联合免疫组的小鼠体内可以检测到两种抗体的存在。值得一提的是,以CAG为启动子的重组腺相关病毒表达的抗体浓度高于以CMV为启动子的重组腺相关病毒表达的抗体浓度。我们利用假病毒中和实验检测了表达抗体的中和活性,结果显示重组腺相关病毒表达的抗体具有很好的中和活性,且中和活性与抗体表达的浓度呈正相关,联合免疫组血清的中和活性优于单独免疫组的血清中和活性。综上,我们成功的利用AAV8为载体,在小鼠体内介导表达了具有中和活性的HIV-1广谱中和抗体,并且抗体的表达时间长达一年。这可能是HIV-1疫苗研究的新方向。