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第一部分口腔鳞状细胞癌细胞系WU-TSC-1的建立及鉴定目的建立一株新的人口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）细胞系WU-TSC-1并鉴定其特性作为进一步实验研究的细胞模型。材料和方法1.收集武汉大学附属口腔医院未接受放化疗的原发OSCC确诊患者手术后切除的组织标本9例,应用酶消法和组织块培养法获得原代细胞。2.通过基因组DNA短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析判断细胞类型及是否存在其它细胞交叉污染。利用相差显微镜观察并记录所获得原代细胞的形态和生长特性以及是否存在细菌及真菌的污染,通过试剂盒检测支原体污染。3.利用CCK8（Cell Counting Kit-8）增殖实验计算所培养细胞的倍增时间。利用刀豆球蛋白A（Concanavalin A,Con A）检测其促凝集功能。4.通过免疫组织化学染色法检测头颈鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）标志物的表达。利用吉姆萨（Giemsa）染色进行染色体核型分析。5.通过体外成球实验检测细胞的干性。通过免疫缺陷小鼠原位移植瘤实验和颈淋巴结转移实验检测其体内成瘤和淋巴结转移能力。6.通过免疫组织化学染色法检测原发灶、移植瘤及所培养细胞中PD-L1的表达。结果1.原发灶的苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）显示分化良好的OSCC,细胞间还可见到细胞间桥,在癌巢的中心可见层状角化物（角化珠）。免疫组织化学染色显示Ki-67（17%）,Cyclin D1（14%）及P53（39%）胞核阳性,P16及HPV16/18染色结果为阴性。2.对来自人口腔鳞状细胞癌的组织块进行原代细胞培养,其中一例观察到上皮样细胞贴壁。所获得的细胞呈多边形或方圆形,与原发灶形态一致。该细胞未观察到细菌、真菌及支原体污染。通过STR对19个基因座及一个性别决定基因座（Amelogenin）进行分析,证实体外所培养细胞的人源性及特异性且无其他细胞交叉污染,并将该细胞命名为WU-TSC-1。3.CCK8实验显示WU-TSC-1细胞数目倍增时间为51.15h。Con A凝集实验显示,成纤维细胞在Con A浓度为100μg/m L时观察到少量细胞聚集,WU-TSC-1在Con A浓度为12.5μg/m L下即观察到凝集现象。4.细胞爬片免疫组化染色显示WU-TSC-1胞浆角蛋白CK5/6表达呈阳性（61%）,Cyclin D1（17%）和P53（98%）胞核阳性表达。染色体核型分析呈现非二倍体染色体,染色体数目和形态差异大。5.WU-TSC-1细胞体外成球率为0.7%。裸鼠体内原位成瘤率为100%,颈淋巴结转移率为25%。6.PD-L1在原发灶、移植瘤及培养细胞中均为阴性表达（TPS＜1%）。结论WU-TSC-1为稳定的、特异的HPV阴性舌鳞状细胞癌细胞系,具备体内成瘤和转移能力,并可能对抗PD-1/PD-L1免疫治疗存在固有免疫耐受。第二部分肿瘤相关成纤维细胞体外对口腔鳞状细胞癌功能的影响目的肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts,CAFs）作为肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中核心细胞成分之一,其对OSCC的进展具有复杂的作用,在本部分中我们将主要探索CAFs对OSCC体外增殖和侵袭能力的影响。材料和方法1.用酶消法分别从9对OSCC组织和癌旁（＞1cm）正常组织中分离培养原代成纤维细胞（Normal fibroblasts,NFs）,分析成纤维细胞标志物α-SMA,Vimentin及FAP在所提取成纤维细胞中的表达及趋势。后续实验所使用的成纤维细胞是第2-8代。2.利用CCK8及克隆形成实验检测CAFs和NFs自身的增殖活性及其对OSCC增殖的影响。3.CAFs与NFs分别与口腔鱗状细胞癌细胞系CAL27及WU-TSC-1在Transwell小室中共培养,观察CAL27及WU-TSC-1的侵袭能力。4.分离CAFs和NFs细胞条件培养基中的外泌体,分别应用两种外泌体共培养CAL27及WU-TSC-1细胞,检测OSCC细胞侵袭能力的改变。结果1.来源于OSCC组织和癌旁正常组织的成纤维细胞均呈长梭形,外观上无明显差异。免疫荧光染色显示两种细胞胞浆均表达α-SMA,FAP和Vimentin。蛋白质印迹（Western blot,WB）结果显示,与对应的NFs相比,α-SMA在所有CAFs中的表达均上调,为NFs的5.69±3.42倍（P＜0.001）,FAP及Vimentin未显示出一致性表达差异。2.CCK8实验显示,与NFs相比,96h时CAFs细胞增殖活性升高了42%（P＜0.001）;克隆形成实验显示,与NFs相比,7天后CAFs条件培养基诱导的OSCC克隆数目增加了86%（P＜0.05）。3.Transwell实验显示CAFs对CAL27侵袭的促进作用显著低于NFs,下降了59%（P＜0.01）。应用WU-TSC-1及其相同患者来源的成纤维细胞进行实验得出一致的趋势,CAFs对WU-TSC-1侵袭的促进作用下降了36%（P＜0.01）。4.BCA（Bicinchoninic Acid Assay）蛋白定量法显示NFs所分泌外泌体数量为CAFs的1.25倍（P＜0.05）。与来源于NFs的外泌体相比,来源于CAFs的外泌体促进OSCC侵袭的作用下降了58%（P＜0.001）。结论OSCC中的CAFs较NFs具有更强的促进肿瘤增殖和抑制肿瘤侵袭的能力。第三部分基于高通量测序预测肿瘤相关成纤维细胞抑制口腔鳞状细胞癌侵袭的潜在分子目的初步分析肿瘤相关成纤维细胞CAFs和癌旁正常成纤维细胞NFs中差异表达的基因。材料和方法1.应用转录组高通量测序（Transcriptome high-throughput sequencing）检测CAFs和NFs中差异表达的mRNAs,对差异表达的m RNAs进行聚类分析。2.利用华大基因Dr.Tom系统将差异表达的m RNAs进行功能富集分析及KEGG pathway富集分析,筛选与侵袭相关的信号分子与通路。3.利用RT-q PCR（Real Time Quantitative PCR）检测CAFs和NFs中部分趋化因子的表达差异。结果1.转录组测序显示平均每个样品产出1.16G的数据。NFs和CAFs样品之间所有m RNAs表达量的Pearson相关系数显示两样本相关性为93.5%。设置筛选标准为log2FC≥1,P value＜0.05,与NFs相比,CAFs中有386个m RNAs上调,542个m RNAs下调。2.GO功能富集分析及KEGG pathway信号通路分析显示CAFs中上调的m RNAs主要集中在细胞收缩与骨架调节相关的信号通路,例如血管平滑肌收缩和c GMP-PKG信号通路;CAFs中下调的m RNAs主要富集于癌症的发展与代谢相关的信号通路,例如细胞因子-细胞因子受体相互作用,PI3K-Akt信号通路。3.RT-q PCR结果显示,与NFs相比,趋化因子CXCL-1,CXCL-2在CAFs中分别下降了81.69%±11.25%及71.46%±29.33%。结论CAFs表现出显著的肌成纤维细胞相关特性,并可能参与抑制肿瘤微环境中的细胞趋化作用。