【摘 要】
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糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性疾病,给社会和家庭带来了巨大的经济负担,所以人类急需开发有效的降血糖产品。目前,糖尿病的治疗主要是依靠节食和药物,其中药物都是人工合成的对人体有相应的副作用。从天然原料提取的DPP-IV抑制肽具有无毒副作用、降血糖效果好、人体易吸收等优点,已成为研究的重点。脱脂南极磷虾粉是南极磷虾经磷虾油提取后剩余的副产品,含有丰富的高质量的蛋白质。脱脂南极磷虾粉产量巨大并且价格
【基金项目】
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国家重点研发计划（项目编号:2019YFD0902000;项目名称:低值水产品及副产物制备活性肽关键技术研发与新产品创制）；
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糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性疾病,给社会和家庭带来了巨大的经济负担,所以人类急需开发有效的降血糖产品。目前,糖尿病的治疗主要是依靠节食和药物,其中药物都是人工合成的对人体有相应的副作用。从天然原料提取的DPP-IV抑制肽具有无毒副作用、降血糖效果好、人体易吸收等优点,已成为研究的重点。脱脂南极磷虾粉是南极磷虾经磷虾油提取后剩余的副产品,含有丰富的高质量的蛋白质。脱脂南极磷虾粉产量巨大并且价格低廉使其具备了较强的利用价值。目前对南极磷虾的研究较多,而对脱脂南极磷虾粉这种新型蛋白源的研究较少,高效利用脱脂南极磷虾粉中的优质蛋白已成为亟待解决的问题。本课题以脱脂南极磷虾粉为原料,通过酶解制备DPP-IV抑制肽,并进一步分离纯化、研究其功效和作用机制,为脱脂南极磷虾粉的高值化利用提供了新的应用思路,主要研究内容与结果如下:（1）以DPP-IV抑制率为指标筛选出了复合蛋白酶为最佳用酶;响应面优化实验确定了最优工艺参数:酶解时间6.0 h、料液比6.12:1、酶添加量0.07 g/g（原料）（4.8×10~3U/g（原料））,预测值为47.99%。验证性实验得到的实验值为48.12%,证明优化模型可靠。（2）利用凝胶色谱对脱脂南极磷虾粉复合蛋白酶酶解产物进行分子量分布测定,结果表明小于3 k Da的组分占97.68%。利用截留值不同的超滤膜对脱脂南极磷虾粉蛋白酶解液进行分离,得到小于3 k Da的C4组分,其对DPP-IV抑制活性最高,在浓度为30 mg/m L时达64.8%。C4组分经Sephadex G-15分离得到的3个组分中C4-2对DPP-IV抑制率最高,在浓度为0.2 mg/m L时达42.0%。C4-2组分被RP-HPLC进一步纯化,又得到3个组分,其中C4-2-3组分对DPP-IV抑制活性最强,在浓度为0.2 mg/m L时,达77.84%,比C4-2组分的DPP-IV抑制活性高出近2倍。（3）通过LC-MS/MS对C4-2-2和C4-2-3进行多肽序列测定,结合DPP-IV结构特点、含量及数据库比对固相合成DPP-IV抑制肽（LAPPRGSL、VDLRSAWP、SEDVHPQA、FAGDDAPR、EDAVPPPQ、RELKPARP和EYPDKRPM）,纯度达98%以上。体外检测其DPP-IV抑制活性,结果表明FAGDDAPR对DPP-IV的抑制活性最高,LAPPRGSL次之。通过分子对接技术对DPP-IV抑制肽（FAGDDAPR和LAPPRGSL）与DPP-IV的作用机制进行了初步探究,模拟出FAGDDAPR和DPP-IV、LAPPRGSL和DPP-IV的结合方式,其中FAGDDAPR与DPP-IV结合能最低,结合的最好,它们与DPP-IV酶活性位点上的氨基酸残基形成氢键、疏水相互作用从而产生抑制功能。（4）对C4组分进行了性能检测,结果表明该组分总氮和多肽含量分别为8.15±0.05%和76.04±2.68%。其体外DPP-IV抑制活性的IC50为15.39 mg/m L。测定该组分的分子量分布显示大部分在1 k Da以下,属于小分子肽。经过胃肠道消化模拟发现C4组分被胃肠消化后DPP-IV抑制活性都有所下降,但相比胃消化的组分,经肠消化后的活性又有所上升。LAPPRGSL经胃消化活性基本没有变化,经肠消化后对DPP-IV抑制活性增强,FAGDDAPR和RELKPARP经胃肠道消化后,对DPP-IV的抑制活性被破坏严重。斑马鱼实验证实C4组分在浓度1000μg/m L时有明显的辅助降血糖功效;在浓度250μg/m L时有明显降血脂功效。
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