论文部分内容阅读
目的:核技术已被广泛应用于工业、能源、环境、食品、农业、医学、军事等诸多领域,但是核事故引起的辐射暴露,威胁着社会的稳定,并严重损害人类的生命健康。造血系统的急性辐射损伤是核事故导致人类死亡的的主要原因,也是肿瘤患者放射治疗后的主要的并发症。电离辐射诱导的造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的损伤是辐射导致造血系统损伤的关键原因。茶黄素(theaflavin,TF)是从红茶中提取出的一种多酚类化合物,能够清除活性氧(reactive oxygen species,ROS),调控细胞内源性抗氧化系统。本研究旨在探讨TF对电离辐射诱导的造血系统损伤的作用。方法:1.筛选给药剂量相关实验:C57BL/6小鼠随机分为对照组(control)、全身照射(total body irradiation,TBI)组、TBI+25mg/kg TF 组、TBI+50mg/kg TF 组、TBI+100mg/kg TF组。所有照射组小鼠接受4GyTBI1次。照射前1天至照射后7天,每天为小鼠灌胃给予不同剂量的TF溶液或等体积溶剂。照射后第15天,称量小鼠体重和脏器重量,计算脏器指数,计数胸腺细胞总数,并用血细胞计数仪检测外周血细胞分类计数。2.胸腺、外周血和骨髓相关实验:根据筛选出的最佳给药剂量,C57BL/6小鼠随机分为control组、TF组、TBI组、TBI+TF组。照射组小鼠接受4Gy或6.5GyTBI1次。4GyTBI后第15天,分离小鼠胸腺,苏木素-伊红染色观察胸腺的组织形态学改变,流式细胞仪检测胸腺中CD4CD8T细胞亚群的变化;取小鼠外周血,用流式细胞仪检测B细胞、T细胞和髓细胞的比例;计数单侧股骨骨髓细胞总数,并用流式细胞仪检测骨髓中造血干祖细胞的比例;苏木素-伊红染色观察骨髓组织形态学改变。3.内源性脾结节:C57BL/6小鼠随机分为control组、TF组、7Gy组、7Gy+TF组。照射后第7天分离小鼠脾脏,观察并统计内源性脾结节的数目。4.竞争性骨髓移植实验:C57BL/6小鼠(CD45.1)作为供体,将其随机分为control组、TF组、4Gy组、4Gy+TF组。照射后第15天取供体小鼠骨髓细胞,与竞争者C57BL/6小鼠(CD45.1+CD45.2+)的骨髓细胞混合后,植入受体C57BL/6小鼠(CD45.2)体内。竞争性骨髓移植实验后2月和4月,检测受体小鼠外周血中的供体嵌合率。5.凋亡和氧化应激相关实验:C57BL/6小鼠随机分为control组、TF组、4Gy组、4Gy+TF组。照射后第15天,流式细胞仪检测小鼠骨髓中造血干祖细胞的凋亡和ROS水平;磁珠分选出骨髓Lineage-c-kit+细胞,用免疫荧光法检测γH2AX和8-羟基氧鸟嘌呤(8-oxoguanine,8-oxoG)的表达水平;并用 Western Blot 检测骨髓 Lineage-c-kit+细胞中核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid2-related factor 2,NRF2)信号通路蛋白及超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)、谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1)和 NADPH 氧化酶 4(NADPH oxidase 4,NOX4)蛋白的表达。6.衰老和外周血相关实验:C57BL/6小鼠被随机分为control组、6.5Gy组、6.5Gy+TF组。照射后2月,流式细胞仪检测小鼠外周血中B细胞、T细胞和髓细胞的比例,骨髓LSKs的比例和ROS水平;并分选出骨髓Lineage-c-kit+细胞,检测β-半乳糖甘酶(β-Galactosidase,β-Gal)阳性细胞的比例和p16Ink4amRNA的表达水平。7.生存率实验:野生型(wildtype,WT)C57BL/6小鼠和Nrf2-/-型C57BL/6小鼠均接受7.2Gy TBI;并于照射前1天至照射后7天每天灌胃给予50mg/kg TF或等体积的溶剂。观察并比较照射后2月内小鼠的生存率。8.Nrf2-/-小鼠实验:Nrf2-/-小鼠被随机分为control组、TF组、4Gy组、4Gy+TF组。照射后第15天,检测Nrf2-/-小鼠骨髓中造血干祖细胞的数量和ROS水平。9.统计分析:计量资料用均值±标准差表示。两组以上的数据,组间差异的比较采用单因素方差分析,事后检验采用Newman-keuls检验进行两两比较。两组数据均值之间的比较采用独立样本t检验。生存分析采用Kaplan-Meier法;生存曲线的比较采用Log-rank检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.50mg/kgTF对受照小鼠体重、脏器指数、胸腺细胞总数、外周血细胞计数的改善作用最佳。50mg/kg被作为后续实验中TF的给药剂量。2.TF能够减轻受照小鼠胸腺的组织形态学改变,促进胸腺CD4CD8T细胞亚群的恢复;并能增加受照小鼠内源性脾结节的数量。3.TF能够减轻受照小鼠外周血髓系偏斜;增加受照小鼠单侧股骨骨髓细胞总数和骨髓造血干祖细胞的比例;改善受照小鼠骨髓组织形态学改变。4.TF能够增加受照骨髓细胞的移植重建能力。5.TF不能改变受照的造血干祖细胞的凋亡率,但是能够减轻受照的造血干祖细胞的氧化应激,并减少其DNA损伤的积累。6.TF能够激活受照的造血干祖细胞内NRF2信号通路,并上调SOD2、GPX1和下调NOX4的表达。7.TF能够抑制受照的HSCs的衰老。8.TF能够提高WT受照小鼠的生存率,但是不能提高Nrf2-/-受照小鼠的生存率。9.TF不能增加Nrf2-/-受照小鼠骨髓中造血干祖细胞的数量,也不能降低其氧化应激水平。结论:TF能够减轻电离辐射诱导的造血系统损伤,具有成为辐射防护剂的潜能。