家蚕微孢子虫总蛋白双向电泳及质谱技术分析平台的构建

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微孢子虫是一类专性细胞内寄生的病原微生物,它能寄生于包括人在内几乎所有的动物体内。家蚕微孢子虫能感染家蚕引起家蚕微粒子病,是蚕业生产上一种重点控制的蚕病。家蚕微孢子虫蛋白质组学研究以总蛋白为研究对象,主要采用双向电泳技术、质谱技术以及生物信息学技术,获得家蚕微孢子虫蛋白质双向电泳参考图,通过质谱分析,鉴定蛋白质,以期找到与微孢子虫侵染、增殖及代谢等重要生理过程相关的蛋白质,为家蚕微孢子虫的基础研究积累更多的知识。1.成熟家蚕微孢子虫总蛋白提取方法的建立。提取家蚕微孢子虫蛋白质的方法主要有化学与物理的方法,化学方法是利用0.1mol/L K2CO3溶液在27℃条件下刺激微孢子虫弹出极管,释放出的孢原质破裂,然后获取蛋白质,此方法简单且提取的蛋白质含量较丰富,但样品中含有大量的盐离子。物理方法主要是采用液氮反复冻融结合研磨,破碎几丁质外壁,用蛋白质抽提液抽提,从而得到蛋白质,此方法较烦琐,但得到的蛋白质含量丰富且样品中盐离子浓度极低,适用于双向电泳,且电泳效果较好。2.家蚕微孢子虫双向电泳参考图谱的建立。通过双向电泳,我们得到一张比较完整的家蚕微孢子虫蛋白质图谱,通过Image master软件分析,可识别的蛋白点有267个。多数蛋白质分子量集中在45KD以下,各pH段都有分布,小分子量蛋白质种类丰富,而大分子量的蛋白质含量较少,特别是碱性区域的大分子量蛋白质极少。3.家蚕微孢子虫本地蛋白质检索数据库的建立及蛋白质谱鉴定。根据家蚕微孢子虫全基因组数据预测出的编码序列,利用GPMAW软件,建立本地蛋白质数据库。从双向电泳图谱共挖点295个(包括重复挖点),通过MALDI-TOF-MS鉴定出的蛋白质点有80个,除去重复后的蛋白质点有50个,其中有功能信息的蛋白质有28个,hypothetical protein有9个,未知蛋白有13个。对有功能信息的蛋白质进行分析,发现其功能涉及到微孢子虫的基本生理活动,包括蛋白质代谢、转录、转座、细胞骨架、细胞修复、死亡、老化、细胞生长、胞内信号传导、蛋白质合成等。结论:通过SDS-PAGE,双向电泳,MALDI-TOF-MS等技术的鉴定分析,我们初步得到了家蚕微孢子虫的蛋白质组双向电泳图谱,同时鉴定了50个蛋白质点,其中包含了一些与重要生理功能相关的蛋白质,建立了微孢子虫双向电泳分析及质谱分析的技术平台,为今后微孢子虫的蛋白质组学深入系统研究打下了坚实基石出。
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