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背景骨骼的应力环境在骨形成及骨重塑过程中发挥着重要的作用。因此,研究机械应力刺激成骨的生物力学信号转导机制,对于认识以及治疗骨质疏松症等骨质减少性疾病具有重要意义。流体剪切力是影响体内骨细胞代谢的主要机械应力刺激模式之一。我们课题组研究表明,流体剪切力可以促进成骨细胞内ERK5的活化,然而ERK5信号通路在成骨细胞力学转导中的具体机制,目前的研究仍较少。目的本研究通过对小鼠MC3T3-E1成骨细胞施加流体剪切力,检测流体剪切力对成骨细胞应力相关通路COX-2/PGE2的影响,探讨ERK5信号通路在其中的调控作用。然后,我们进一步研究了流体剪切力对NO/cGMP/PKG信号通路的影响,探讨NO/cGMP/PKG信号通路在流体剪切力活化ERK5中的作用。方法第一部分:本部分实验分为空白对照组,流体剪切力组,ERK5 siRNA组,流体剪切力+ERK5 siRNA组。对小鼠MC3T3-E1成骨细胞加载12dyne/cm2的流体剪切力45min,应用siRNA沉默ERK5基因,采用PGE2试剂盒检测成骨细胞内PGE2的含量,通过RT-PCT检测成骨细胞中ERK5、COX-2 mRNA表达,通过Western blot检测成骨细胞内ERK5、COX-2、CREB和NF-κB蛋白表达的变化。另外,分别沉默(或抑制)CREB和NF-κB活性后,观察COX-2蛋白表达的影响。第二部分:本部分实验分为空白对照组,流体剪切力组,流体剪切力+L-NAME组,流体剪切力+ODQ组,流体剪切力+(Rp)-8-pCPT-PET-cGMPS组,流体剪切力+PKG-I siRNA组和流体剪切力+PKG-II siRNA组。对小鼠成骨细胞施加生理强度为12dyne/cm2的流体剪切力45min后,分别使用NOS抑制剂L-NAME、sGC抑制剂ODQ、PKG抑制剂(Rp)-8-pCPT-PET-cGMPS抑制NO/cGMP/PKG通路。通过Western blot技术检测成骨细胞内eNOS、sGC、PKG-I、PKG-II和ERK5的活化情况,另外,应用siRNA分别沉默PKG-I和PKG-II基因,观察两者对ERK5活化和核转位的影响。结果第一部分:与空白对照组相比,加载流体剪切力后成骨细胞内p-ERK5蛋白、COX-2 mRNA和蛋白的表达以及PGE2的合成量明显增加(p<0.05),转录因子p-CREB和p-NF-κB的表达量也显著升高(p<0.05);与单纯流体剪切力组相比,应用60 nM ERK5 siRNA干预48h后,成骨细胞内的p-ERK5的表达量显著降低(p<0.05),同时COX-2蛋白的表达、PGE2的合成量以及p-CREB和p-NF-κB的表达量也显著降低(p<0.05)。在沉默CREB基因和抑制NF-κB蛋白活性后,成骨细胞内COX-2蛋白的表达量明显减少(p<0.05)。第二部分:与空白对照组相比,加载流体剪切力能够显著刺激成骨细胞内NO和cGMP合成以及p-NOS、sGC、PKG-I、PKG-II和p-ERK5等蛋白的表达(p<0.05);与单纯流体剪切力组相比,在流体剪切力加载循环液中加入L-NAME、ODQ、(Rp)-8-pCPT-PET-cGMPS后,p-ERK5表达量显著下降(p<0.05)。应用siRNA沉默PKG-II基因后,与单纯流体剪切力组相比,p-ERK5蛋白的表达量显著下降(p<0.05),同时免疫荧光结果也发现成骨细胞内ERK5的核转位减少(p<0.05),而siRNA沉默PKG-I则无明显变化。结论在流体剪切力作用下,ERK5信号通路能够促进转录因子CREB和NF-κB表达,进一步调控COX-2/PGE2通路的表达。另外,流体剪切力可以通过NO/cGMP/PKG信号通路促进成骨细胞内ERK5的活化和核转位。