论文部分内容阅读
目的:探讨miR-216b是否能通过靶向作用于ABCG1 3’UTR并抑制其表达,观察过表达或沉默miR-216b后对破骨细胞分化、融合、生存的影响及相关机制。方法:应用生物学信息分析网(microRNA.org)及在线软件寻找与ABCG1能靶向结合的Micro RNAs,分析与预测各物种间miR-216b的保守性、靶基因、ABCG1 3’UTR序列及miR-216b ABCG1结合自由能、结合位点等基本信息。不同浓度(0、10、20、40、80nm)miR-216b mimics或miR-216b inhibitor及不同时间(0、12、24、48h)处理细胞,通过TRAP染色检测破骨细胞生成情况,计算TRAP阳性成熟破骨细胞数目、直径及融合核数目;实时定量PCR检测ABCG1 m RAN表达水平,Western blot检测ABCG1蛋白质表达水平。miR-216b mimics、miR-216b inhibitor或miR-216b inhibitor+ABCG1 si RNA转染细胞48h后,通过TRAP染色检测破骨细胞生成情况,计算TRAP阳性成熟破骨细胞数目、直径及融合核数目;实时定量PCR检测ABCG1 m RAN表达水平,Western blot检测ABCG1蛋白质表达水平,液体闪烁计数仪检测其胆固醇流出情况。结果:生物学信息分析网及在线软件分析结果显示miR-216b在多物种间具有高度保守性,多个靶标预测网站发现miR-216b能与ABCG1 3’UTR发生靶向结合并调控其靶标基因的表达。miR-216b能抑制ABCG1蛋白及m RNA的表达,且对ABCG1蛋白表达的调节具有时间与浓度依赖性,进而增加破骨细胞数目、直径、融合核数目,促进RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化、融合及其生存。miR-216b inhibitor能上调ABCG1蛋白及m RNA的表达,且对ABCG1蛋白表达的调节具有时间与浓度依赖性,进而减少破骨细胞数目、直径、融合核数目,抑制RAW264.7巨噬细胞向破骨细胞分化、融合及其生存。miR-216b inhibitor与ABCG1 si RNA同时处理细胞后,证实miR-216b通过下调细胞内ABCG1蛋白表达,减少细胞内胆固醇流出。结论:miR-216b通过靶向抑制ABCG1的表达减少破骨细胞内胆固醇流出,促进破骨细胞分化、融合及生存。