引言：周围神经缺损的修复仍是外科领域的一大难题，临床上主要采用自体神经移植的方法修复，但有明显的缺陷。组织工程为修复周围神经缺损提供了新的方法，本研究的目的就是利用激活态雪旺细胞和生物可吸收材料几丁糖—胶原膜构建人工神经，探索一种修复周围神经缺损的有效方法。本研究共分五部分： 第一部分 改良植块法培养成年大鼠雪旺细胞 目的：通过改良植块培养，探索快速获得高纯度成年大鼠雪旺细胞的培养方法。 方法：成年SD大鼠20只，分二组，每组10只大鼠，A组改良植块法，B组传统植块法。取大鼠坐骨双侧坐骨神经剥除外膜后，剪成0.5mm~3小块。A组：植块用0.03％胶原酶消化20分钟后培养；B组：植块直接培养。植块隔5天反复培养，传代纯化，共3次。通过细胞计数比较每次植块所得细胞量，雪旺细胞S—100染色测定纯度。 结果：改良植块法在细胞数量和纯度上均高于传统植块法，改良植块法第一次植块培养所得主要为成纤维细胞，起到分离成纤维细胞的目的，第二次雪旺细胞纯度较高85％，经纯化后可以达到95％，第三次植块雪旺细胞纯度95％。经3次反复植块就可以完全利用神经植块。 结论：改良植块法可以快速获得高纯度的雪旺细胞，方法简单，廉价。 第二部分 激活态雪旺细胞培养及其增殖规律研究 目的：1．利用预变性神经和激活液培养激活态雪旺细胞 2．比较激活态雪旺细胞和正常雪旺细胞的增殖能力 方法：SD大鼠10只，200g～250g。右侧坐骨神经切断一周后取材，剥除神经外膜，称重，用0.03％胶原酶加激活液(0.1ml/ml消化液)，按照改良植块法培养激活态雪旺细胞。左侧坐骨神经取材剥除外膜后称重，称重，用0.03％胶原酶消化，按照改良植块法培养正常雪旺细胞。比较单位神经所得的细胞量。取1×10~5的第二代细胞分别接种35个培养皿，通过各时间点(2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d)计数，绘制生长曲线，计算倍增时间，比较激活态雪旺细胞和正常雪旺细胞增殖能力。培养第8天细胞计数后提取蛋白，western blot法比较两者CDK1的含量。取接种前及培养第14天的雪旺细胞作S—100染色。 结果：改良植块第二次培养7天后，每毫克预变性神经可得到7.5×10~4个激活态雪旺细胞正常神经为1.5×10~4个正常雪旺细胞。传代培养后，激活态雪旺细胞在培养2天后计数均高于正常雪旺细胞，具有统计学差异(p＜0.01)，激活态雪旺细胞倍增时间5天，正常雪旺细胞为7天，激活态雪旺细胞增殖快于正常雪旺细胞。而且western blot测定激活态雪旺细胞CDK1含量高于正常雪旺细胞。 结论：神经预变性刺激雪旺细胞增殖，利用预变性7天的神经培养可以获得大量激活态SC，而且激活态SC增殖能力均高于正常SC，可能与激活了CDK1有关。 第三部分： 激活态雪旺细胞GAP43、BDNF、C-JUN、P21 mRNA表达研究 目的：比较激活态雪旺细胞和正常雪旺细胞GAP43、BDNF、C-JUN、P21基因表达区别，寻找激活态雪旺的marker，分析激活态雪旺细胞增殖及促进神经再生的机制。 方法：选取10只SD大鼠，将大鼠右侧坐骨神经切断，1周后取右预变性坐骨神经改良植块法培养激活态雪旺细胞；取左侧正常坐骨神经培养正常雪旺细胞作为对照。自细胞提取mRNA，应用rt-PCR的方法扩增GAP43、BDNF、C-JUN、P21基因，取PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，拍照，图像分析计算目标基因和内标基因(GAPDH)PCR产物的吸光度比值，以配对t检验比较。 结果 激活态雪旺细胞GAP43、c-Jun、P21PCR产物积分吸光度比值较正常雪旺细胞明显增高，差异有统计学意义(P＜0.001)。表明激活态雪旺细胞较对照组正常雪旺细胞GAP43 mRNA表达明显增多。正常雪旺细胞培养未检测到BDNFmRNA，而激活态雪旺细胞BDNFmRNA表达明显，两者有质的区别。 结论 1．BDNF可以作为激活态雪旺细胞的marker区别于正常雪旺细胞 2．激活态雪旺细胞GAP43、BDNF、c-Jun、P21基因表达增强，可能是其促进神经再生和加速细胞增殖的原因之一。第四部分 激活态雪旺细胞在几丁糖—胶原膜上生长规律的研究 目的：研究激活态雪旺细胞在几丁糖—胶原膜上的生长规律和亲和力，探索两者构建人工神经的可能性。 方法：成年SD大鼠的坐骨神经切断预变性7d，改良植块法培养激活态雪旺细胞。以1×10~5数量接种于几丁糖—胶原膜上和培养皿。通过相差显微镜观察细胞生长情况，培养2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d各取5皿细胞计数，绘制生长曲线，计算倍增时间。培养3、7、10天几丁糖—胶原膜行扫描电镜观测细胞情况。 结果：相差显微镜和扫描电镜下观察显示激活态雪旺细胞在几丁糖—胶原膜上贴壁生长情况良好。2周后细胞量在几丁糖—胶原膜和培养皿上分别达到10.26×10~5和7.22×10~5个，体外倍增时间分别为4天和5天。激活态雪旺细胞在几丁糖胶原膜上的增殖速度快于培养皿。 结论：几丁糖—胶原膜具有促进激活态雪旺细胞增殖的作用，两者具有良好的亲和性。以几丁糖—胶原膜为载体可以进行激活态雪旺细胞移植是可行的。 第五部分 激活态雪旺细胞和几丁糖—胶原膜修复周围神经缺损的实验研究 目的 1．研究几丁糖—胶原膜和激活态雪旺细胞促进周围神经再生的作用，探索修复神经缺损的方法 2．比较激活态雪旺细胞和正常雪旺细胞修复神经缺损的能力，为激活态雪旺细胞应用提供实验依据 方法 自体激活态雪旺细胞和自体正常雪旺细胞培养于几丁糖—胶原膜，将膜缝制成导管修复大鼠坐骨神经10mm缺损，以单纯几丁糖胶原复合膜管及自体神经移植做对照，术后4、8、12周，行大体观察，测量肌电图动作电位波幅和传导速度。术后12周取材，通过小腿肌肉测量、组织学切片观测与计算机图像分析测量有髓神经密度和髓鞘厚度进行效果评价。 结果 几丁糖—胶原膜加自体激活态雪旺细胞在肌电图、肌肉湿重和神经再生质量和数量方面与自体神经移植无明显差异，激活态雪旺细胞组比正常雪旺细胞组效果好，而单纯的几丁糖胶原膜修复效果较差。 结论 1．几丁糖胶原复合膜加激活态雪旺细胞能有效促进周围神经再生 2．激活态雪旺细胞比正常雪旺细胞促进神经再生的能力强