论文部分内容阅读
纤维素酶是水解纤维素及其衍生物等多糖生成单糖的一类酶的总称，能够解决自然界中纤维素类物质燃烧造成的资源浪费和环境污染的问题。内切葡聚糖酶作为纤维素酶的重要功能成分，在纤维素酶降解纤维素的过程中扮演着重要的角色。克隆内切葡聚糖酶基因并实现异源高效表达，有助于了解内切葡聚糖酶的降解特性，从而提高纤维素酶降解纤维素的能力。对此，本论文从绿木霉T.virensZY-01中克隆得到内切葡聚糖酶EGⅣ基因，并对其进行异源表达，进一步对目的蛋白进行纯化，研究其酶学特性，为提高纤维素酶的酶活，实现高效降解纤维素及高效生产提供基础。 首先，提取绿木霉T.virens ZY-01的RNA，利用RT-PCR的方法克隆得到内切葡聚糖酶EGⅣ的基因，将其连接至可溶性表达载体pET-32a上，并将其转化至E.coliDH5α。利用菌落PCR和质粒双酶切验证重组质粒pET32a-EGⅣ，对鉴定正确的重组质粒进行测序，测序结果显示，目的基因EGⅣ的开放阅读框为1069 bp，编码356个氨基酸，与Trichoderma viride AS3.3711菌株相比，核酸序列同源性高达95.2％，氨基酸的同源性高达100％。 为了检测目的基因的表达情况，通过热激法将重组质粒转化至表达宿主细胞BL21(DE3)中，含有T7启动子的重组质粒在IPTG的诱导下，能高效表达目的蛋白。对诱导液进行破胞，并对破胞后的粗酶液进行亲和层析镍柱纯化，SDS-PAGE分析破胞前后的上清和沉淀，测量酶液纯化前后的酶活和蛋白含量，从而计算比酶活。SDS-PAGE结果显示重组蛋白是胞内酶且可溶，目的蛋白的分子量约为39 kDa，重组葡聚糖内切酶EGⅣ的粗酶液的比酶活为0.93 U/mg，亲和层析纯化之后，比酶活提高到6.04 U/mg，纯化了6.5倍。 为了进一步实现内切葡聚糖酶在反应的过程中酶解能力达到最大，分别测量重组酶在不同条件下降解羧甲基纤维素钠的能力，对重组葡聚糖内切酶的动力学参数，最适反应温度、最适反应pH，酶的热稳定性、pH稳定性等进行研究。结果显示，重组内切葡聚糖酶的Km=13.71 mg/mL，Vmax=0.51μmol/min，其最适反应温度和pH分别为45℃和pH7.4，重组内切葡聚糖酶在20-50℃以及pH=5-8的范围内有较好的稳定性，Mn2+促进重组酶的酶解过程，然而Ni2+抑制重组酶的酶解过程，且Mn2+的最适促进浓度为2.5 mmol/L。 本文的主要采用基因工程技术对绿木霉T.virens ZY-01中的内切葡聚糖酶进行研究，了解其降解能力及酶学特性，有助于实验室进一步地对绿木霉T.virensZY-01中的其他相关基因进行研究，以及了解其分子结构，对其进行定向突变或者改造，从而增强其降解纤维素的能力，为实验室对绿木霉T.virens ZY-01中相关基因进行基因工程菌的构造奠定基础。