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目的:本实验采用氯化钙（CaCl2）和弹性蛋白酶分别外敷腹主动脉的经典方法制备大鼠腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）模型。探索携带Klotho的干细胞外泌体（exosome,EXO）对大鼠AAA的治疗作用及潜在机制,为AAA的治疗提供理论和实验依据。方法:1、大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）在完全培养基中正常培养到70%左右进行换液,换成无外泌体血清配制成的完全培养基后再培养48h后进行收集培养基。将收集的培养基进行差速离心方法（300g、2000g、10000g、100000g的离心力）分离外泌体。收集的外泌体进行Western blot检测CD9、CD63、TSG101,然后用透射电镜观察形态,经NTA分析外泌体粒径的分布。2、在大鼠骨髓间充质干细胞长至70%时进行转染过表达Klotho和GFP,转染后的干细胞进行培养。当细胞量达到70%时,更换无血清培养基培养48h后收集外泌体、培养基和细胞,随后进行提取蛋白进行Western blot检测。3、构建携带Klotho蛋白的干细胞外泌体。使用Exo-Fect（?）si RNA/mi RNA Transfection Kit试剂盒将Klotho蛋白在4℃转染至收集的外泌体1h,然后13000rpm离心10min后用PBS重悬,便可得到转染Klotho的外泌体。随后提取外泌体蛋白用Western blot检测Klotho转染成功与否。4、制备脂肪组织脱细胞水凝胶。新鲜的猪脂肪剪碎后,过物理、化学和酶处理后,冷冻干燥研磨后得出DAT粉末。将DAT称重塑封后,环氧乙烷灭菌。将DAT粉末溶于盐酸胃蛋白酶溶液,4℃下搅拌48h后,将p H调至中性,即可得到DAT水凝胶。将外泌体与DAT水凝胶4℃充分搅拌,制备得外泌体水凝胶。5、应用富含外泌体的水凝胶（Hydrogel）分别治疗CaCl2诱导的大鼠腹主动脉瘤和弹性蛋白酶诱导的大鼠腹主动脉瘤。两种动物模型的Wistar大鼠均随机分为:N（正常对照）组、AAA组、AAA+Hydrogel组、AAA+Hydrogel+MSC-EXO组、AAA+Hydrogel+EXO（KL）组,CaCl2诱导AAA模型和弹性蛋白酶诱导AAA模型分别于术后4周、2周血管取材,进行相关指标的检测。6、测量腹主动脉的管径,HE染色观察动脉壁总体变化,地衣红染色观察弹力板的形态变化,Masson染色观察胶原纤维的含量变化。免疫组化检测动脉管壁炎症反应变化;免疫荧光检测平滑肌标志物α-SMA的表达变化。7、体外条件下培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,根据对VSMCs的不同处理分为:N组（正常对照组）、N+TNF-α组、N+Klotho组、N+TNF-α+Klotho组。N组作为正常对照组,不做任何处理;应用TNF-α（100 ng/ml 48 h）单独处理VSMCs,以此模拟体内AAA发生时的炎症环境。除TNF-α组外,其他组细胞用Klotho进行处理。对培养处理后的细胞提取蛋白,进行Western Blot检测。结果:1、通过透射电镜（TEM）我们发现提取的外泌体为周围凸起、中间凹陷的杯状结构。外泌体的Western blot鉴定结果显示,在提取的外泌体中CD9和CD63、TSG101的表达水平远高于间充质干细胞。另外,NTA结果显示所提取的外泌体直径分布在100nm左右,这些外泌体鉴定结果表明,提取的外泌体符合定义。2、过表达Klotho的骨髓间充质干细胞（MSC）的细胞蛋白和培养基蛋白中均含有Klotho蛋白,但过表达Klotho的MSC分泌的外泌体中并不含有Klotho蛋白。3、Klotho蛋白转染外泌体后提取外泌体蛋白进行Western blot检测后可以发现,转染后Klotho蛋白表达上调,而正常外泌体并不表达。结果显示,Klotho蛋白转染外泌体成功。4、制备完成的DAT粉末是白色、松散的外表,整体蓬松细腻。制备完的DAT水凝胶在室温下具有流动性,在37℃下30min就可以热凝固,不再具有流动性。5、体内实验的外泌体水凝胶治疗部分:CaCl2诱导AAA组的腹主动脉管径较N组明显扩张,MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后管径扩张程度减弱,携带Klotho外泌体水凝胶治疗后显著抑制动脉管壁的扩张;弹性蛋白酶诱导AAA组的腹主动脉管径同样较N组明显扩张,MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后管径扩张程度减弱,携带Klotho外泌体水凝胶治疗后管径收缩程度更加显著。HE染色观察腹主动脉管壁的形态,由结果可知AAA组较N组动脉管径增大,MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后相对于AAA组改善了管径增大,携带Klotho外泌体水凝胶治疗后相对于AAA组有显著地改善。地衣红染色表明,AAA组弹力板失去波浪形膜状、出现平直、断裂现象,MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后弹力板抑制了动脉管壁弹力板的断裂,经携带Klotho外泌体水凝胶治疗后可显著抑制动脉管壁弹力板的断裂。免疫组化结果表明,AAA组炎症因子CD45、CD68、TNFα、MCP-1均为高表达,MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后降低了炎症水平,经携带Klotho外泌体水凝胶治疗后可显著降低腹主动脉的炎症水平。免疫荧光结果表明,AAA组的α-SMA含量较N组表达量显著降低,MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后α-SMA含量较AAA组表达量升高,携带Klotho外泌体水凝胶治疗后相对于AAA组有明显地提高。组织中的Notch3经免疫组化检测发现,AAA组较N组中Notch3的表达水平严重下降,经MSC-EXOs外泌体水凝胶治疗后较AAA组Notch3水平上升,经携带Klotho外泌体水凝胶治疗后可显著恢复组织中的Notch3水平,接近N组表达水平。此外,在弹性蛋白酶诱导的大鼠腹主动脉瘤模型,同样证实携带Klotho外泌体水凝胶治疗后可显著抑制腹主动脉瘤的发展。6、体外实验中,Western Blot检测发现,Klotho蛋白的作用会增强Notch3信号表达。在TNF-α的作用下,MYOCD表达会明显下调,而经过klotho蛋白处理后MYOCD的表达水平则明显上调。进一步的Western Blot检测的实验中可以看出,Klotho蛋白处理的细胞能够逆转TNF-α处理后模拟炎症环境所带来的NF-κB p65蛋白表达的上调以及弹性蛋白（elastin）的下调,接近正常水平。结论:携带Klotho的MSCs外泌体可以减轻CaCl2诱导和弹性蛋白酶诱导的AAA的发展,其机制可能是Klotho通过抑制炎症和增强平滑肌细胞Notch3表达来达到减轻AAA症状的目的。