论文部分内容阅读
亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)分布于荒漠和半荒漠地区,生境主要在胡杨林和灌丛,宿主为牛、羊、马、野猪和双峰驼,也侵袭人。亚洲璃眼蜱可传播新疆出血热、Q热、环形泰勒虫病等多种自然疫源性疾病。防御素是一种抗菌多肽,在机体先天免疫系统中发挥重要作用,研究蜱源防御素对探索蜱与病原体之间的关系、开发抗蜱药物和控制蜱传疾病具有重要意义。本研究以亚洲璃眼蜱为研究对象,提取总RNA后利用Clontech建库试剂盒构建cDNA文库,利用PCR技术进行分子克隆,得到五条防御素基因,分别命名为Ha-defensin-1、Ha-defensin-2、Ha-defensin-3、Ha-defensin-4和Ha-defensin-5。开放阅读框大小分别为219bp、222bp、222bp、207bp、和222bp,编码氨基酸个数为73、74、74、69和74,等电点分别为9.08、9.54、9.89、5.53和9.99。与NCBI发布的其他蜱源防御素的氨基酸序列相似性范围为53%~82%。对Ha-defensin-1和Ha-defensin-2进行原核表达并研究重组蛋白的功能。分别将Ha-defensin-1和Ha-defensin-2连入表达载体pET-32(a+)转入Transetta(DE3)感受态细胞中表达,并进行表达条件的摸索和优化,表达产物经SDS-PAGE电泳显示目的蛋白大小约25kDa,与预测大小一致。利用Real-time PCR技术对Ha-defensin-1和Ha-defensin-2的表达情况进行初步分析,结果显示Ha-defensin-1和Ha-defensin-2基因的表达具有时期、组织和不同菌胁迫时的特异性。通过抑菌圈实验、最小抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定,结果显示重组蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌有抑菌活性,但存在差异性。抗氧化实验结果显示重组蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2对ABTS·+和DPPH·自由基具有一定的清除能力。溶血活性实验结果显示重组蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2在86.8μM和93.8μM浓度下的溶血率分别为5.58%和6.39%。对亚洲璃眼蜱防御素生物学功能的研究为揭示蜱类先天免疫机制和开发新型生物制剂奠定了基础。