环糊精具有独特的中空立体结构，可以包合多种客体分子，广泛应用于食品、医药等领域。环糊精葡萄糖基转移酶（以下简称CGT酶）可以利用淀粉及其相关基质通过分子内转糖基反应合成环糊精，通常用于环糊精的工业化生产。CGT酶产物特异性较差是工业上生产环糊精不利的因素之一，已知野生CGT酶生产的都是α-、β-和γ-环糊精的混合物，不利于产物的分离和纯化，且大幅增加了环糊精的生产成本。因此，着力于提高CGT酶的产物特异性以适应环糊精工业化生产的需要显得尤为重要。本论文通过定点突变技术改善来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）STB01CGT酶的产物特异性，实现了CGT酶β-环糊精特异性的提高。首先，通过多重序列比对和晶体模拟分析，发现钙离子结合位点普遍存在于α-淀粉酶家族中，其钙离子结合位点处多为侧链短小且亲水性较强的氨基酸残基，并探索了CGT酶钙离子结合位点（CaI，CaII和CaIII）的结构与功能。分析研究表明，钙离子结合位点CaII在不同来源的α-淀粉酶和CGT酶中保守性较高，多位于酶活性中心，其突变往往对酶活力产生剧烈影响；而CaI和CaIII在不同来源的CGT酶中呈现一定特异性，其中CaI处U型扭曲结构顶端第31位氨基酸残基在α、α/β、β/α-CGT酶中主要为丝氨酸（S），在β-、β/γ-CGT酶中主要为丙氨酸（A）；而CaIII仅存在于少数CGT酶中。研究显示，钙离子结合位点处氨基酸残基适当突变能在一定程度上改变CGT酶的环化活力、热稳定性和产物特异性，这可能对于构建具有更高β-环糊精特异性的突变体具有指导意义。其次，通过对来源于B. circulans STB01CGT酶第31位氨基酸残基（Ala31）的适当突变，并将突变cgt基因表达于Bacillus subtilis WB600中，提高了CGT酶的产物特异性。结果显示，Ala31分别突变成精氨酸、脯氨酸和苏氨酸提高了CGT酶的β-环糊精特异性。突变体A31R、A31P和A31T的β-环糊精的产量比野生CGT酶分别提升25.8%、16.1%和9.7%；Ala31突变为丝氨酸提高了CGT酶的α-环糊精特异性；而Ala31突变为谷氨酸提高了CGT酶的γ-环糊精特异性。突变体在β-环糊精特异性上的提高可能是由于突变稳定了钙离子结合位点，从而稳定了CGT酶特定构象，利于β-CGT酶大量生产β-环糊精；而突变体在α-或γ-环糊精特异性上的提高可能是由于该类型突变撞击钙离子和附近氨基酸残基，不利于钙离子结合位点的稳定，降低β-CGT酶生产β-环糊精的能力，而环糊精产物抑制作用的减弱却促进了α-或γ-环糊精的生产。β-CGT酶的突变体N29K、A31G和α-CGT酶的突变体T31A、T31S的构建进一步证实钙离子结合位点稳定性有利于β-CGT酶生产β-环糊精。最后，通过对钙离子结合位点CaIII处第315位进行适当突变发现，该位点突变为亲水性较强的氨基酸残基提高B. circulans STB01CGT酶的β-环糊精特异性，而突变为疏水性或略亲水性氨基酸残基则没有明显变化。突变体A315R和A315D具有较高的β-环糊精生成能力，其β-环化活力比野生CGT酶分别增加12%和10%，最终环化产物中，突变体A315R和A315D的β-环糊精产量比野生CGT酶分别提高15.1%和10.8%；而A315T、A315V和A315I突变对CGT酶产物特异性则没有显著影响。突变体在β-环糊精特异性上的提高可能是亲水性较强的氨酸残基有利于分布在CGT酶表面，且稳定了该处钙离子结合位点的结果。总的来说，具有更高β-环糊精特异性的突变体A315R和A315D可能更适合于β-环糊精的工业化生产。此外，CaIII处Asp577的适当突变也能在一定程度上影响CGT酶的产物特异性，这也说明了钙离子结合位点CaIII对于CGT酶的产物特异性具有重要作用。另外，钙离子结合位点CaI和CaIII处的适当突变均能改变CGT酶对钙离子的响应值，这进一步说明钙离子结合位点对于CGT酶的环化反应是重要的。