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顺铂(DDP)作为一种抗肿瘤药物在多种类的肿瘤细胞中都表现出优良的治疗效果,现已在临床中应用多年。但在使用过程中顺铂所呈现出的细胞耐药性也成了医学界需要攻克的一大难题。Pleitrophin(PTN)又名肝素结合生长因子,它与孕中期肾蛋白(Midkine)生物学功能及基因结构相似,两者组成了一个全新的蛋白家族,命名为肝素结合生长/分化家族。PTN是一种在多种肿瘤细胞内高表达的分泌性蛋白,在某些肿瘤细胞中也表现出一定的抗细胞凋亡活性。在已经发现的与顺铂耐药性关联的抗凋亡蛋白研究中并未见PTN蛋白。本课题从Bxpc-3胰腺癌细胞的c DNA中克隆出PTN基因,并将其克隆到Ptracer-EF/V5-His质粒中,将该真核载体转染293T细胞进行瞬时表达,得到外源表达的PTN蛋白,根据PTN蛋白的促细胞生长功能判断其具有生物学活性,并将其纯化备用。在浓度梯度顺铂作用的PC3细胞中,加入外源表达的PTN蛋白,MTT实验结果证明PTN刺激顺铂处理的PC3细胞后其IC50值较未加PTN组有明显升高,说明PTN蛋白在顺铂作用细胞过程中起到抗凋亡的作用,降低了细胞对顺铂的敏感性;利用不同浓度的PTN蛋白刺激顺铂处理的PC3细胞的流式,结果发现这种对细胞产生的抗凋亡作用呈现一定的浓度依赖性。为了进一步探究PTN蛋白对顺铂敏感性的影响,本研究利用sh-PTN干扰载体沉默PTN蛋白在PC3细胞中的表达,检查细胞对顺铂的敏感性及细胞的凋亡情况。将sh-Scramble、sh-PTN-1、sh-PTN-2转染PC3细胞24h后,比较两种sh-RNA的干扰效率在m RNA及蛋白水平的表达哪种更为明显,琼脂糖电泳及western结果显示sh-PTN-2的干扰效率更佳。在PTN下调的PC3细胞中与正常PC3细胞对比,顺铂对其作用的IC50值有明显的降低,即提高了顺铂的敏感性;随后的流式实验中证明,转染了sh-Scramble质粒的PC3细胞组与Control组相比,加入顺铂后的细胞凋亡情况并未有太大变化,而在转染了sh-PTN-2质粒的PC3细胞中,顺铂诱导该组细胞的凋亡率较前两组有一定幅度的增加,这也证明了PTN的沉默提高了PC3细胞对顺铂的敏感性。同时western blot实验证明在PTN沉默的PC3细胞中,加入顺铂后其C-PARP蛋白的表达量较对照组明显增高,作为又一验证PTN调节顺铂敏感性的指标。综上所述,PTN可能是一种潜在的与顺铂敏感性相关的抗凋亡蛋白,为顺铂耐药性的研究提供了研究基础。