MicroRNAs (miRNAs)是真核生物中发现的内源性非编码小分子单链RNA,大约由18-25个核苷酸组成,主要参与基因转录后水平的调控,通过与靶mRNA的3’-UTRs完全或不完全互补结合,引起靶mRNA的降解或翻译抑制,在包括器官发育、细胞增殖、分化、凋亡等生命过程中发挥着巨大的作用。研究发现超过50%的microRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点,它们通过对靶mRNA的调控,影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、血管形成和转移,参与肿瘤发生发展的各个阶段。研究显示,许多肿瘤组织中microRNA相对于其正常组织表达异常,这些microRNA可作为瘤基因或抑瘤基因,在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。miR-21是人类组织和细胞中较早发现的microRNA之一,位于17号染色体TMEM49基因编码区域内,全长22个核苷酸,在多种组织中广泛表达,有其自身的启动子区域。目前已证实,miR-21在脑胶质瘤、喉癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤中异常表达,参与众多肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管浸润和转移等过程,介导放疗及药物抵抗,作用机制涉及多条信号通路,其靶基因具有组织特异性,被认为是一个潜在的肿瘤治疗靶点。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤,其发病有显著地理差异,好发于东南亚及我国南方地区,其中以广东、广西、湖南等省发病率最高。病理类型多为低分化或未分化癌,恶性程度高,侵袭性强,短期可发生远处转移,Ⅲ～Ⅳ期患者五年生存率仅30%。随着放射治疗技术的改进、化疗及靶向药物的综合应用,鼻咽癌患者的局部控制率和生存率得到改善,但局部复发及远处转移仍是鼻咽癌治疗的瓶颈,缺乏有效的治疗手段。肿瘤干细胞假说认为,肿瘤组织内存在一小部分具有自我更新能力和多向分化潜能的肿瘤干细胞,是肿瘤的“本源”,传统放疗、化疗只能杀死已分化或分化中的肿瘤细胞,肿瘤干细胞是肿瘤治疗后复发转移的根本原因。大量研究证实上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤细胞转移和迁徙的先发条件,肿瘤干细胞通常兼有EMT的属性。上皮向间充质转化通常表现为：细胞间粘附减弱；细胞形态从多边形向梭形转化；同时伴有上皮标志物E-cadherin的表达下调和间充质标志物N-cadherun、Vimentin、Fibronectin等表达上调。近期研究表明,miR-21在鼻咽癌患者血浆中高表达,且其表达量与肿瘤大小及范围(T分期)、区域淋巴结受累情况(N分期)显著相关,联合测定miR-21等五个microRNA的血浆表达水平可作为鼻咽癌诊断的无创性指标,其诊断灵敏度为87.7%,特异性为82.0%。然而miR-21在鼻咽癌组织中的表达谱、miR-21在鼻咽癌发生发展的作用,目前尚未见报道。基于miR-21的研究现状及其在鼻咽癌发生发展的潜在意义,本课题研究目的为：明确miR-21在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株中的表达谱,验证miR-21在鼻咽癌增殖、凋亡、迁移、侵袭、EMT及放射抵抗性方面的作用并探讨其机制。我们通过上调和下调miR-21的表达水平明确其对鼻咽癌细胞生物学行为的影响,随后进行下游基因的筛选和验证,初步探讨miR-21在鼻咽癌发生发展中所扮演的角色及其机制,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础,为此本课题进行了如下研究：方法：1.检测鼻咽癌组织标本及细胞株中miR-21的表达谱运用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测CNE1、CNE2, SUNE1、HONE1、5-8F、6-10B及C666-1共7种鼻咽癌细胞株miR-21的表达谱,以永生化鼻咽上皮细胞株NP69作为对照。收集鼻咽癌组织标本48例和慢性鼻咽炎症组织标本20例,运用qRT-PCR方法检测以上68例组织标本中miR-21的表达谱。结果分析运用2-△△Ct方法进行比较。2.下调鼻咽癌细胞中内源性miR-21表达水平对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭、及放射抵抗等生物学行为的影响利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR-21抑制物(miR-21inhibitor)转染至CNE2鼻咽癌细胞中,转染后分别于24小时、48小时、72小时及96小时收集细胞并提取RNA, qRT-PCR检测转染后的细胞miR-21表达水平以评价抑制效果。生长曲线(MTT法)检测下调miR-21表达后细胞体外增殖能力的改变。流式细胞技术检测下调miR-21表达后细胞凋亡情况的改变。细胞划痕实验及Transwell小室实验检测下调miR-21表达后细胞体外迁移能力的改变；Boyden小室实验检测下调miR-21表达后细胞体外侵袭能力的改变。Western Blot从蛋白水平检测下调miR-21表达后细胞EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表达水平的变化。直线加速器照射不同处理组鼻咽癌细胞株后,运用流式细胞技术检测细胞凋亡情况。直线加速器照射不同处理组鼻咽癌细胞株后,运用克隆形成实验检测细胞克隆形成情况。3.上调鼻咽癌细胞中miR-21表达水平验证miR-21如上功能利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR-21模拟物(miR-21mimics)转染至6-10B鼻咽癌细胞中,转染后分别于24小时、48小时、72小时及96小时收集细胞并提取RNA, qRT-PCR检测转染后的细胞miR-21表达水平以评价过表达效果。生长曲线(MTT法)检测上调miR-21表达后细胞体外增殖能力的改变。流式细胞技术检测上调miR-21表达后细胞凋亡情况的改变。细胞划痕实验及Transwell小室实验检测上调miR-21表达后细胞体外迁移能力的改变；Boyden小室实验检测上调miR-21表达后细胞体外侵袭能力的改变。Western Blot从蛋白水平检测上调miR-21表达后细胞EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表达水平的变化。直线加速器照射不同处理组鼻咽癌细胞株后,运用流式细胞技术检测细胞凋亡情况。直线加速器照射不同处理组鼻咽癌细胞株后,运用克隆形成实验检测细胞克隆形成情况。4.初步筛查鼻咽癌细胞中miR-21的下游蛋白Western Blot从蛋白水平检测干扰CNE2、6-10B鼻咽癌细胞miR-21表达水平后PTEN、PDCD4、RECK表达水平的变化。结果：1.鼻咽癌组织标本和细胞株中miR-21的表达谱运用qRT-PCR方法检测48例鼻咽癌组织和20例慢性鼻咽炎症组织中miR-21的表达,结果显示,与慢性鼻咽炎症组织相比,鼻咽癌组织中miR-21的表达水平明显上调(图1A,P<0.001),且miR-21的表达水平与肿瘤大小及范围(T分期,P=0.0223)、区域淋巴结受累情况(N分期,P=0.0012)及临床分期(P=0.0266)显著相关(表1)。qRT-PCR方法检测CNE1、CNE2. SUNE1、HONE1、5-8F.6-10B及C666-1共7种鼻咽癌细胞株miR-21的表达谱,以永生化鼻咽上皮细胞株NP69作为对照。结果显示,miR-21在CNE2、SUNE1、HONE1、5-8F及C666-1等5种鼻咽癌细胞株中的表达水平高于NP69(图1B,P<0.05),而miR-21在CNE1、6-10B两种细胞株中的表达水平略低于NP69,其差异无统计学意义(图1B,P>0.05)。2.干扰鼻咽癌细胞中内源性miR-21表达水平对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭及放射抵抗等生物学行为的影响利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR-21抑制物(miR-21inhibitor)导入CNE2鼻咽癌细胞中,同时将miR-21模拟物(miR-21mimics)导入6-10B鼻咽癌细胞中,分别于转染后24小时、48小时、72小时、96小时收集细胞并提取RNA, qRT-PCR检测各组细胞miR-21的表达,结果显示,与各自的对照组(NC)相比,miR-21的抑制及过表达效率在转染后96小时仍达80%以上,为后续实验奠定基础(图2A、B)。2.1细胞增殖生长曲线(MTT法)实验结果表明下调miR-21表达可抑制CNE2细胞体外增殖(图3A),而上调miR-21表达可促进6-10B细胞体外增殖(图3B)。2.2细胞凋亡凋亡实验结果表明下调miR-21表达后CNE2细胞凋亡比例增加,而上调miR-21表达后6-10B细胞凋亡比例减少(图4,表2)。2.3细胞迁移能力细胞划痕实验、Transwell小室实验结果均表明下调miR-21表达水平后CNE2细胞体外迁移能力减弱(图5A、C)。然而上调miR-21表达水平后6-10B细胞的体外迁移能力增强(图5B、D)。2.4细胞侵袭能力Boyden小室实验结果显示,下调miR-21表达水平减弱了CNE2细胞体外侵袭能力(图6A)。上调miR-21表达水平则促进6-10B细胞体外侵袭能力(图6B)。2.5EMT相关基因表达Western Blot从蛋白水平检测干扰miR-21表达水平后细胞EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达水平的变化。结果显示,抑制miR-21后CNE2细胞的E-cadherin表达水平上调,N-cadherin、Vimentin表达水平下调(图7A)；过表达miR-21后6-10B细胞的E-cadherin表达水平下调,与此同时N-cadherin、Vimentin表达水平上调(图7B)。以上实验表明,miR-21促进鼻咽癌细胞发生EMT。2.6细胞放射抵抗性对照组及实验组细胞均接受8Gy放疗照射后24小时,运用流式细胞分析仪检测不同处理组间细胞凋亡比例的变化。结果显示,抑制miR-21后CNE2细胞的凋亡比例增加(P=0.0220)；过表达miR-21后6-10B细胞的凋亡比例减少(P=0.0390)(图8)。对照组及实验组细胞均接受8Gy放疗照射后24小时,进行克隆形成实验检测不同处理组细胞克隆形成能力的变化。结果显示,抑制miR-21后CNE2细胞的克隆形成数量减少(P=0.0236)(图9A、C)；过表达miR-21后6-10B细胞的克隆形成数量增多(P=0.0158)(图9B、C)。以上实验表明,miR-21增加鼻咽癌细胞的放射抵抗性。3.初步筛查鼻咽癌细胞中miR-21的下游蛋白Western Blot检测miR-21抑制实验及过表达实验后,细胞PTEN、PDCD4、 RECK蛋白水平的变化。结果显示,抑制miR-21后CNE2细胞的PTEN表达水平无明显变化,过表达miR-21后6-10B细胞的PTEN表达水平亦无明显变化。抑制miR-21后CNE2细胞的PDCD、RECK表达水平上调,与此同时过表达miR-21后6-10B细胞的PDCD4、RECK表达水平下调(图10),提示在鼻咽癌细胞中,miR-21抑制PDCD4及RECK蛋白的表达。结论：相对于慢性鼻咽炎症组织,miR-21在鼻咽癌组织标本中表达升高,且表达量与肿瘤T分期、N分期及临床分期呈正相关。相对于NP69, miR-21在CNE2、SUNE1、HONE1、5-8F及C666-1等5种鼻咽癌细胞株中的表达水平增高。细胞体外实验证实,miR-21减少鼻咽癌细胞凋亡,促使鼻咽癌细胞发生EMT,促进鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭,增加其放射抵抗性。miR-21在鼻咽癌细胞中抑制PDCD4及RECK蛋白的表达。