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杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy,DMD）,是一种由于X染色体上隐性基因突变导致肌肉细胞不能正常表达Dystrophin蛋白,进而引起的全身性肌肉萎缩疾病,全球大约每3500个男孩中就有一个罹患此疾病。目前,针对此类疾病研究最多的治疗方法是基因治疗和细胞治疗。基因治疗中,虽然反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides,AOs,如MOE、PMO、2’-OMe）介导外显子跳读已然显示出了种种优越性,但其仍存在靶向性差、药物运输效率低、生物利用率低、药物安全性不足等瓶颈。Exosome为细胞分泌的直径为45-120nm的囊状小泡,具有与细胞膜类似的磷脂双分子层结构。基于生物体自体来源的特性,exosome兼具低免疫原性、潜在靶向性、可穿过血脑屏障、易进入细胞等优点。因此,利用exosome作为载体递送基因治疗药物是解决AOs的递药问题的优选手段。本研究旨在通过对成肌细胞C2C12来源的exosomes的提纯和鉴定来获得理想的药物载体,将基因治疗药物AOs装载入成肌细胞来源的exosomes,从而提高基因治疗DMD的效率,达到治疗DMD的目的。利用透射电镜、激光共聚焦显微镜、Nanosight、流式细胞技术等分别对exosomes的粒径分布、特征生理途径、肌肉细胞系对exosomes的摄取能力等进行逐一研究和表征;尝试利用电击转染和两种物理手段进行药物的装载;采用RT-PCR、PCR等方法检验药物装载和治疗结果;胫骨前肌（Tibialis Anterior,TA）肌肉局部注射药物体系,通过免疫组化处理肌肉组织冷冻切片来探究药物在疾病模型鼠中的治疗效果。实验研究结果表明,利用过滤与超速离心相结合的方法所获得的成肌细胞C2C12来源的exosomes,具有粒径分布均一、入胞途径和胞内行为与文献报道相符、有肌肉细胞和组织的倾向性等特点。所获得的exosomes平均粒径大小在110nm左右,分布较为均一;透射电镜下可见杯状囊泡样双层膜结构,说明本文所述的提取方法可以保留exosomes的完整结构,方案可靠;利用激光共聚焦显微镜将其与早期内涵体、晚期内涵体分别进行荧光共定位,发现exosomes在早晚期内涵体中均有蓄积,说明所得到的exosome与文献报道中exosomes在细胞中的行为途径一致,从而进一步验证所获得的囊泡为exosomes;在不同肌肉细胞系对成肌细胞C2C12来源exosomes的摄取探究中发现,exosomes可以进入多种肌肉细胞。药物装载实验证实了exosomes可以作为AOs进入肌肉的运输载体,实验结果证明,利用物理方法对exosomes与AOs的混合物进行处理,装载后的exosomes可以在细胞水平介导外显子跳读;将载药exosomes局部注射到小鼠肌肉中发现,通过物理手段得到的载药exosomes表现出了一定的治疗作用。总之,成肌细胞C2C12来源的exosomes可以成为AOs的药物良载体。AOs可以介导外显子跳读,而生物自体来源的纳米囊泡exosomes作为一种新兴的生物药物载体正在受到越来越广泛的关注。在此,釆用一系列物理手段将以上两者结合,利用肌肉来源的exosomes运送AOs,通过其介导外显子跳读而生成半功能性膜骨架蛋白,从而的达到治疗杜兴肌肉萎缩症的目的。随着人类对生命科学的不断探究和生物医学工程技术的持续进步,以蛋白类药物为代表的生物大分子药物在抗肿瘤药物的研究中占有举足轻重的地位。相较阿霉素（Doxorubicin,DOX）、紫杉醇（Paclitaxel,PTX）等小分子化学药物,大分子抗肿瘤药物有着极高的生物活性。以核糖体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein,RIP）为例,它是一类植物来源的酶类毒素,具有高效的细胞杀伤能力,一旦进入细胞后,能够在极低剂量的情况下高效阻断真核细胞中的蛋白质翻译过程,抑制细胞生长。Gelonin是一种29 kDa大小的核糖体失活蛋白,来源于大戟科植物（Gelonium multiflorum）种子,可以高效地抑制蛋白的合成。因此,核糖体失活蛋白Gelonin可以成为高效的肿瘤治疗生物药物。为了充分利用Gelonin的生物活性、增强其肿瘤杀伤效果、提高其生物利用度,本研究完成了两部分工作:1、将生物大分子蛋白药物Gelonin与小分子化学药物阿霉素联合用药,利用两种药物的协同作用杀灭肿瘤细胞,并且解决阿霉素在乳腺癌细胞中的耐药问题（人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR）;2、采用低分子量鱼精蛋白（Low Molecular Weight Protein,LMWP）和聚乙二醇（Polyethylene Glycol,PEG）对Gelonin进行定点修饰,以期增加其肿瘤杀伤效力和生物利用度。采用几丁质柱、分子筛等对大肠杆菌表达的蛋白进行提取和纯化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱分析等对所获得的蛋白进行分析和鉴定;采用倒置荧光显微镜、流式细胞分析技术可以分别获悉肿瘤细胞对Gelonin、联用药物、蛋白修饰体系的定量和定性摄取情况;利用小动物活体成像技术可以观察药物体系在荷瘤动物模型体内的分布情况;利用Western blot技术对耐药机制相关蛋白P-gp的表达量进行考察;采用MTT法、流式细胞凋亡检测技术等对药物体系进行体外药效检测;将药物在荷瘤动物模型进行瘤旁注射,通过监测肿瘤体积来对药物进行体内药效学的评价;对动物主要脏器的苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）切片进行分析,并测量动物的体重变化,从而对药物的安全性进行评价。联合用药的实验结果表明,分离纯化所得到的蛋白分子量在聚丙烯酰胺凝胶电泳图中位于29 kDa处,且质谱分析结果中所有肽段的序列均与数据库中的蛋白序列一致,证实了所获得的蛋白即目的蛋白Gelonin;药物联用摄取实验结果显示了在Gelonin的作用下,耐药细胞株对阿霉素的摄取量明显增加;在体外药效的检测中,联合用药的促细胞凋亡作用大于单独用药之和,且MTT结果显示联合用药可以大幅度降低阿霉素的用药量;Western blot结果显示,Gelonin可以减少促阿霉素外排的P-gp的表达;动物体内治疗实验结果表明,联合用药组的瘤重和瘤体积均小于阿霉素和Gelonin单独给药,两种药物联合使用抑瘤效果明显;组织切片结果和脏器系数均证实了现用剂量下药物体系的毒副作用较低,联用给药的方式并没有对动物主要脏器造成明显损伤;体内药效学的评价中,联用药物的抑瘤作用明显,瘤重及瘤体积均较对照组有明显减少。同时,利用FPLC纯化经LMWP与PEG5000修饰后的Gelonin,可以获得纯度比较高的修饰产物;细胞摄取定性和定量实验结果表明,修饰后的蛋白进入HT1080细胞系的能力较Gelonin有显著提高;修饰后的蛋白体系较未修饰蛋白的毒性增强;未修饰的Gelonin主要蓄积于肾脏与肝脏,经LMWP和PEG5000修饰的药物体系在肿瘤内有较高蓄积。总之,核糖体失活蛋白Gelonin是一种高效的肿瘤杀伤药物。Gelonin与阿霉素的协同作用可以增强对阿霉素耐药肿瘤的杀伤能力;穿膜肽的连接和PEG化的修饰,可以提高Gelonin对肿瘤细胞的毒性及其在动物体内肿瘤部位的蓄积。