论文部分内容阅读
青杆(Picea wilsonii)又称魏氏云杉或华北云杉,属于松科云杉属植物,是我国特有的常绿针叶树种,也是重要的园林绿化树种及用材林树种,具有极高的生态价值。随着全球环境的恶化,干旱已经成为全球范围内影响生态平衡及农林业生产的主要环境因素之一,青杆的生存环境也随之受到威胁,其分布范围正在逐年减少,因此阐明其抗逆机制,挖掘其自身抗逆基因至关重要。本研究以青杆为试验材料,利用NCBI网站的Protein BLAST功能及RT-qPCR手从青杆转录组数据中筛选出响应干旱胁迫的目的基因。通过逆境和激素处理下目的基因的表达量分析、组织特异性分析、染色体步移、酵母双杂交、亚细胞定位及转基因等试验对目的基因的耐旱性进行了深入研究和验证。主要研究结果如下:1.本研究从青杆转录组中筛选出5个响应干旱胁迫的基因,分别为PwPEBP、PwMBF1c、PwRhomboid(RBL)、PwWD40和PwREF。对其进行组织特异性及逆境和激素处理下的表达量分析,结果表明,5个基因均在青杆成熟针叶中表达量最高;在逆境和激素处理中,5个基因均对干旱胁迫有强烈响应,在ABA诱导下,基因表达量明显上升或下降;除了响应干早胁迫及ABA处理以外,PwRhomboid基因表达量在低温和SA处理下均显著上升;PwMBF1c基因表达量在高温、MeJA和SA处理下也明显上升,其中在高温诱导下表达量显著上升至对照的104倍。2.通过注射农杆菌瞬时表达烟草叶片的方法进行3个目的蛋白的亚细胞定位试验,结果显示,PwPEBP和PwMBF1c主要定位在细胞核和细胞质中,而PwRhomboid定位在细胞膜上。3.通过染色体步移法克隆出PwPEBP的903 bp启动子,启动子活性分析试验,结果显示,PwPEBP启动子对干旱诱导有强烈响应;酵母双杂交试验证实了 PwMBF1c C端具有自激活活性。4.在转基因马铃薯中,PwPEBP、PwMBF1c及PwRhomboid的转基因苗在15%和20%的PEG6000处理下,苗高和生长状态均优于野生型,说明这3个基因均能提高植物的耐旱性.5.在转PwMBF1c基因拟南芥的2个株系幼苗试验中,不同浓度甘露醇胁迫下,过表达株系根长长于野生型和转PCM1205株系,但种子萌发率略低于野生型株系;在成苗干旱处理7 d后,转基因株系中叶绿素含量下降程度明显低于野生型和转PCM1205株系,野生型和转PCM1205株系的MDA含量也显著高于转基因株系;干旱处理16 d后进行复水,转基因株系存活率均达到达高到86%以上,显著高于野生型株系,进一步说明PwMBF1c基因能提高植物的旱耐能力。