脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的病理过程包括原发性和继发性损伤，前者指暴力发生时脊髓的不可逆性损伤，后者是在此基础上发生的局部缺血、水肿、电解质紊乱等一系列生理生化反应。缺血缺氧和炎症反应均能引起活性氧(reactive oxgen specieces，ROS)的产生和释放，ROS大量堆积导致局部组织氧化损伤，神经细胞发生凋亡和坏死。寻找有效药物减少脊髓神经元继发性死亡，一直以来都是人们研究的热点。雷帕霉素（Rapamycin, Rap）是肾移植术后抗排斥反应药物，是一种高效的免疫抑制剂。近期发现，雷帕霉素又具有上调自噬的作用。中枢神经系统创伤性疾病研究显示，雷帕霉素会随动物种类和疾病模型不同而发挥截然相反的作用，脊髓损伤时，雷帕霉素是否具有神经保护作用，目前尚无定论。本研究建立大鼠脊髓损伤模型，观察雷帕霉素对损伤脊髓是否具有保护作用；选择H2O2氧化损伤PC12细胞模型，进一步探讨雷帕霉素对神经细胞的保护作用机制，通过NF-kB和NLRP3炎症小体表达情况，初步探索自噬和炎症之间相互作用的关系，论文分以下两部分阐述。第一部分雷帕霉素对脊髓撞击损伤大鼠的神经保护作用目的：建立大鼠脊髓损伤模型，观察雷帕霉素是否具有上调自噬、下调炎症以及抑制凋亡的神经保护作用。方法：Wistar雌性大鼠45只。开椎板假手术组3只，42只大鼠制备脊髓撞击损伤模型，随机分成雷帕霉素治疗组和损伤对照组。术后3d、7d、14d取材，进行H-E染色、ED-1染色、GFAP免疫荧光染色，观察脊髓损伤病理学变化；酶组织化学法检测组织髓过氧化物酶(MPO)浓度；Western blot法检测炎性因子TNF-α、IL-1β、自噬相关蛋白Beclin-1的表达；TUNEL法检测脊髓组织细胞凋亡指数；NF免疫组化染色观察脊髓组织中存活神经元。结果：成功建立大鼠脊髓撞击损伤模型，术后3d雷帕霉素治疗组MPO值低于损伤组(P<0.05)，Western blot结果显示雷帕霉素组炎性因子IL-lβ，TNF-α表达低于损伤组(P<0.05)，自噬相关蛋白Beclin-1表达高于损伤组。术后7d ED-1阳性小胶质细胞在雷帕霉素组明显少于损伤对照组(P<0.05)，术后14d GFAP荧光染色阳性星型胶质细胞，雷帕霉素组有减少趋势，但与损伤组之间无显著性差异。H-E染色结果显示，在损伤区与正常脊髓交界处，损伤组炎症细胞数目较多。TUNEL结果显示，雷帕霉素组凋亡细胞数目明显减少(P<0.05)。NF染色显示，雷帕霉素组神经元数目明显多于单纯损伤组(P<0.05)。结论：雷帕霉素作用于大鼠脊髓撞击损伤，不仅可以上调自噬；而且能够抑制小胶质细胞活化和增殖、减少中性粒细胞及淋巴细胞浸润，减少炎性因子表达，减轻了神经组织继发性炎症反应；雷帕霉素最终减少凋亡细胞数量，增加神经元存活，对损伤脊髓具有保护作用。第二部分雷帕霉素对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用及机制研究目的：观察雷帕霉素预处理对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用，从自噬和炎症之间的关联信号通路探讨雷帕霉素保护作用的机制。方法：实验共分五组：正常PC12细胞组；H2O2+PC12组；RAP+H2O2+PC12组；RAP+SN50+H2O2+PC12组；3-MA+H2O2+PC12组，制备H2O2氧化损伤PC12细胞模型。MTT法检测各组细胞存活率；光学显微镜观察细胞形态学变化；MDC染色观察细胞自噬囊泡变化；ROS染色观察细胞活性氧变化；ELISA法检测培养上清和细胞内炎性因子TNF-α、IL-1β变化；Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3，促凋亡蛋白Bax、Cleave-caspase3，炎症信号通路NF-kB、炎症小体NLRP3、炎性因子IL-1β表达变化。结果：200μM H2O2处理PC12细胞24h，成功构建氧化损伤细胞模型。MTT法结果提示Rap和Rap+SN50组与H2O2组比较，细胞存活率增加；3-MA组与H2O2组比较，细胞存活率减少。ROS染色显示H2O2组和3-MA组的平均荧光强度与正常组比较明显增高，Rap和Rap+SN50组与H2O2组比较荧光强度明显减少。MDC染色后发现H2O2组自噬囊泡数量较多；Rap和Rap+SN50组细胞内自噬囊泡荧光颗粒明显增强；3-MA组细胞自噬囊泡数量较少。ELISA结果显示H2O2组细胞损伤后培养上清和细胞内TNF-α、IL-1β分泌水平明显增高；而Rap和Rap+SN50组TNF-α、IL-1β分泌水平降低。Western blot结果显示Rap和Rap+SN50组自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达明显高于H2O2组，而3-MA组LC3和Beclin-1的表达明显低于H2O2组；炎症通路蛋白NF-кB和NLRP3表达在Rap和Rap+SN50组明显低于H2O2组，而3-MA组NF-кB的表达明显高于H2O2组；促凋亡蛋白Bax和Cleave-caspase3表达在Rap和Rap+SN50组低于H2O2组，而3-MA组Bax和Cleave-caspase3的表达则明显高于H2O2组。结论：在H2O2氧化损伤PC12细胞模型中，雷帕霉素通过上调自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达，减少损伤线粒体ROS释放，下调NF-kB信号通路和NLRP3炎症小体活化，减少炎性因子TNF-α、IL-1β表达，雷帕霉素下调促凋亡蛋白Bax和Cleave-caspase3表达，增加PC12细胞存活，具有神经细胞保护作用。综上所述，我们在大鼠体内和体外培养PC12细胞实验证实，雷帕霉素具有神经保护作用。初步探讨其可能存在的机制：脊髓损伤后，雷帕霉素上调自噬水平，减少ROS产生，通过NF-kB和NLRP3信号通路减少炎性因子的产生和释放，雷帕霉素下调促凋亡信号，减少死亡细胞数量；在脊髓损伤区域，由于死亡细胞炎性因子释放减少，下调了周边炎性细胞活化和增殖迁移，减小局部炎症反应强度，雷帕霉素减少凋亡细胞数量，保护了残存神经细胞。