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综述了双水相技术的研究进展和现状，并着重就近年来备受关注的金属螯合亲和分配技术，温度诱导相分离技术的原理、特点和应用进行了较为全面的分析。在此基础上提出了温度诱导双水相金属螯合亲和分配技术。论文主要包括三方面的内容：含金属配基成相剂的制备、含亲和配基系统液液平衡性质的考察以及利用温度诱导双水相金属螯合亲和分配技术分离蛋白质的基础和工艺研究。 对以PEG为载体，含亲和配基成相剂PEG-IDA-Cu（Ⅱ）的制备工艺进行了优化，重点考察了制备过程中羟基活化方法，IDA偶联条件等影响因素。从热力学分析着手，提出了改进的二氯亚砜活化法，使活化效率明显提高，氯取代度为1.54 mol Cl／mol PEG,但IDA对Cl-的取代率较低，仅在55％左右；环氧氯丙烷法虽然环氧基取代率相对较低，但由于环氧键的高度活性，PEG-环氧与IDA反应转化率高达95％。选用环氧氯丙烷活化方法，在优化的反应条件下，PEG-IDA产物中IDA的含量约为0.93mol／mol PEG；亲和配基Cue2+的最大螯合量为0.83molCu2+／mol PEG。 为了实现温度诱导双水相分配和金属螯合亲和分离两项技术的结合，必须制备出新型的具有较低浊点温度的金属螯合亲和基质。本文对温度诱导型亲和基质EOPO-IDA-Met的制备路线进行了探讨和优化。通过将EOPO端羟基活化成环氧基，结合上IDA后，螯合金属离子，得到含金属螯合亲和配基成相剂EOPO-IDA-Me。EOPO环氧化的优化反应条件为：无溶剂、冰水浴，BF3·C2H5OC2H5浓度为0.5mL／g EOPO，环氧化反应21h，40％NaOH用量为0.20mL／g EOPO，加入NaOH后反应5h，环氧得率为86％；EOPO-环氧偶合IDA的较优反应条件为：稀NaOH溶液调节反应的pH为10.5，加入两倍摩尔比IDA，48℃反应，产物中IDA取代度为78％。Cu2+比Ni2+更容易与EOPO-IDA螯合，最后得到的EOPO-IDA-Met中，金属配基含量分别为0.70 mol Cu(2+0／mol EOPO，0.45 mol Ni2+／mol EOPO。 采用甲醛滴定法测定（NH4）2SO4、间接络合滴定法测定Na2SO4、旋光法测定PES、真空干燥法测定水含量，考察了PEG／（NH4）2SO4、PEG／PES、EOPO／Na2SO4以及EOPO／PES双水相系统的相平衡随亲和配基加入的变化情况。结果表明：双水相系统中，金属螯合亲和配基的加入对相图的影响很小。随着亲和配基取代度的增加，上下相间憎水性差异略微增大，结线斜率逐渐减小，上相聚合物的浓度略微增大。相对而言，金属配基的加入，对含PEG系统的影响大于对含EOPO系统的影响，对聚合物／盐系统的影响大于对双聚合物系统的影响。 考察了聚合物浓度变化对EOPO、EOPO-IDA以及EOPO-IDA-Cu（Ⅱ）水溶液 浙江大学博士学位论文的浊点温度的影响。随着聚合物浓度的提高，溶液的浊点温度先下降后上升。亲和配基制备过程中，由于保持了EOPO主体聚合物的结构和聚合度，环氧乙烷和环氧丙烷的配比及无规分布亦未发生变化，三者的浊点温度相近，变化规律相似。NaZso4的添加对EOPo和EoPo一IDA一c矿+水溶液浊点的影响一致，都将导致聚合物水溶液浊点的降低。测定了不同温度下EOPo/ NaZSO;系统的相平衡数据，温度的提高将大大降低系统分相所需的成相物质浓度。系统温度较高，且EOPO的含量一定时，随着NaZSO;加入浓度的增高，系统会出现均相一温度诱导相分离一双水相的变化。 考察了双水相分配过程中，亲和作用的存在对纳豆激酶分配的影响。详细考察了成相剂、聚合物分子量、浓度、亲和配基加入量、溶液的pH值、相比以及生物质加入量等因素的影响。结果表明，①亲和配基的加入能显著提高金属鳌合蛋白在上相的分配系数;②双聚合物系统对纳豆激酶的亲和分离效果相对较好;③纳豆激酶在PEG/PES、EOPO/PES双水相系统中的亲和分配行为受亲和配基的种类、浓度以及系统pH值的影响十分显著;④利用温度诱导双水相金属鳌合亲和分配技术可以直接从发酵液中分离提取纳豆激酶，并可实现聚合物的回收和循环利用。选用6%EOpO+4%EOpo一IDA一eu（11）+120，0 PEsloo系统对纳豆激酶进行一次分配，发酵液加入量15%，pH 8.2时，分配系数约为10.8，酶活回收86%，纯化因子为1.87。分离出富含EOPO及亲和配基的上相，在体系中加入适量的NaZSO4和金属鳌合剂EDJ…A，利用温度诱导效应对纳豆激酶进行二次分配，实现了目标蛋白与聚合物的分离。纳豆激酶收率为83%，总纯化因子为2.47。聚合物收率为75%。采用简洁的亲和分配模型，对纳豆激酶在双聚合物亲和分配体系中的实验数据进行了关联，计算值与实验值符合较好，误差(14%。 考察了小分子伴侣在双水相系统中的亲和分配行为，实现了利用温度诱导双水相金属鳌合亲和分配技术从E.coli破胞液中分离提取小分子伴侣。双聚合物系统中，小分子伴侣及杂蛋白均趋上相分配，于分离不利;利用EOPO闪aZSO4系统能较好得从破胞液中分离小分子伴侣，亲和作用的结果使得目标蛋白富集于上相，而杂蛋白和细胞碎片主要集中于下相和相界面上。设计了从破胞液中提取小分子伴侣的循环萃取流程，小分子伴侣的收率达80%以上，电泳结果表明达到了一定的纯度，大