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研究背景:寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)是一种蚊媒传播病毒,属于黄病毒属病毒。寨卡病毒主要通过伊蚊传播,人感染寨卡病毒后,一般表现为无症状感染,少数出现轻度发热、疲乏、头痛、关节痛及皮疹等轻微的临床症状,几乎不会导致严重的疾病或并发症,所以一直以来寨卡病毒并没有引起人们的重视。自2015年5月以来,寨卡病毒在南美地区暴发流行,寨卡病毒感染被怀疑与新生儿小头畸形及成人吉兰·巴雷综合征等严重神经系统疾病有关。随着疫情蔓延至全球80多个国家,其引起的严重危害引起了人们的普遍关注。寨卡病毒在全球范围内严重危害人类健康,然而,目前并没有针对寨卡病毒的特异性有效药物或疫苗,因此亟需开发能有效治疗寨卡病毒的药物。寨卡病毒非结构蛋白在病毒复制过程发挥着重要作用。NS5的C端RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)介导基因组RNA的从头合成;NS2B-NS3蛋白酶是病毒蛋白多聚体的重要切割酶。这两个蛋白序列由于高度保守使其成为抗寨卡病毒药物开发的理想靶标。研究目的:本课题分别研究喹唑啉酮类小分子2-(4-溴苯基)-7,7-二甲基-1,3-二苯基-2,3,4,6,7,8-六氢喹唑啉-5(1H)酮(Q63)以及黄酮醇类中药单体杨梅素的抗寨卡病毒活性并阐述其作用机制,为开发安全有效的抗寨卡病毒药物提供新的参考。研究方法:1.抗寨卡病毒活性初步筛选。采用噬斑形成抑制实验、CPE抑制实验检测Q63及杨梅素对子代寨卡病毒释放的抑制作用,以及MTT实验评价化合物的毒性作用。2.采用RT-PCR检测系列浓度化合物对寨卡病毒RNA转录水平的抑制效果;ELISA及western blot实验检测化合物降低寨卡病毒蛋白合成水平的抑制作用;3.Time of drug addition实验证实化合物Q63作用于病毒生活周期的阶段;RT-PCR、噬斑形成实验、ELISA方法分别验证杨梅素作用于病毒生活周期的具体阶段及其与病毒结合后的起效时间。4.采用ITC实验检测Q63与NS5-RdRp、MTase之间的相互作用,利用FRET实验测定杨梅素抑制NS2B-NS3蛋白酶活性。实验结果:Q63与杨梅素均具有较好的抗寨卡病毒活性,其半数抑制浓度(IC5G)分别为1.98、0.58 μM,其中Q63作用于病毒进入后的复制阶段,杨梅素作用于病毒生活周期的早期阶段。Q63能浓度依赖抑制寨卡病毒RNA、蛋白水平,作用于病毒复制的早期阶段,与NS5-RdRp有较强的结合力;杨梅素与寨卡病毒结合后迅速起效,病毒活性抑制率接近100%,杨梅素抑制NS2B-NS3蛋白酶活性的IC5G与其抑制病毒活性的IC55G一致。实验结论:喹唑啉酮类小分子化合物Q63靶向NS5-RdRp,抑制寨卡病毒复制阶段基因组RNA从头合成活性,从而起抗寨卡病毒作用。而来源于天然植物的中药单体杨梅素作用于寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶,抑制病毒生活周期的早期阶段而具有较好的抗寨卡病毒活性。综上Q63与杨梅素都是具有较好潜力的抗寨卡病毒先导化合物。