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研究背景宫颈癌是女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤,与高危型HPV感染直接相关,近年来发病率呈上升和年轻化的趋势。晚期宫颈癌以放化疗为主。由于放化疗抵抗以及放化疗的毒性反应,晚期宫颈癌的5年生存率为50%左右。热疗引起细胞凋亡和坏死,同时具有放化疗增敏优势,在宫颈癌的综合治疗中提高了5年生存率和局部控制率,而远期毒性反应没有增加。热疗对宫颈癌的作用机制尚不清楚。传统的热疗认为43℃是大多数细胞发生凋亡的临界点,但近期研究发现,43℃热疗并不是对所有种类的癌细胞均具有杀伤作用。细胞对热疗的敏感性与细胞的种类和基因特征有关。探索不同细胞株对热疗的敏感性有助于临床个体化的热疗方案。磁热疗是一种新兴的热疗手段,与传统的热疗方式相比具有靶向定位升温的优势,而对周围正常组织的损伤小,在国外的前列腺癌等Ⅱ期临床试验中显示较好的疗效,但是对宫颈癌的研究未见报道。因此,我们采用不同温度体内外加热宫颈癌细胞,探讨不同温度热疗对细胞凋亡和增殖的影响,以及凋亡的内在作用机制,为热疗在宫颈癌的临床运用提供部分理论依据。第一章不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响目的探讨不同温度热疗对宫颈癌Caski细胞凋亡、增殖以及细胞周期的影响。方法采用水浴对宫颈癌Caski细胞行43℃、45℃、47℃实验组和37℃对照组热疗,四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡率、坏死率和细胞周期的变化,免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果45℃,47℃组的细胞增殖抑制率在24h、48h、72h、96h分别为76.11±5.32%、81.08±4.03%、74.71±3.78%、72.16±4.75%和88.57±3.77%、91.33±2.43%、91.09±1.17%、92.05±1.67%,明显高于43℃组的26.57±3.46%、25.49±2.76%、22.80±3.16%、26.87±4.01%（P<0.05）。45℃与47℃组的细胞增殖抑制率之间的差异无显著性（P>0.05）。45℃组的细胞凋亡率最高,为12.82±1.77%,与其它各组之间的差异具有显著性（P<0.05）。47℃组的细胞坏死率最高,为39.15±5.67%,各组之间的差异均有显著性（P<0.05）。43℃、45℃、47℃组的G1期细胞比对照组明显减少（P<0.05）,而S期细胞明显增加（P<0.05）。PCNA的表达随着热疗温度的增加而降低。45℃,47℃组的平均光密度值（AOD）分别是0.228±0.022、0.214±0.018,与对照组和43℃相比差异具有显著性（P<0.05）。结论45℃及以上的热疗能够明显抑制Caski细胞的增殖,增加凋亡率和坏死率,细胞周期阻滞在S期,降低PCNA的表达。第二章热疗诱导Smac/DIABLO表达促进Caski细胞凋亡目的研究宫颈癌Caski细胞经过不同温度热疗后凋亡相关基因p53、Smac/DIABLO、survivin、caspase-3的表达变化。方法采用水浴对宫颈癌Caski细胞行43℃、45℃、47℃热疗40min,实时荧光定量PCR检测不同温度热疗后继续培养2h、6h、12h、24h HPV16E6、p53、Smac/DIABLO、survivin、caspase-3在mRNA水平的表达变化。Western Blotting检测不同温度热疗后2h、6h、12h、24h Smac/DIABLO、survivin、caspase-3在蛋白水平的表达变化。免疫组化检测不同温度热疗后24h caspase-3蛋白在细胞内的表达变化。结果（1） 43℃热疗后各时间点HPV16E6、Smac/DIABLO、survivin、caspase-3 mRNA的表达均比对照组增加（P<0.05）。与对照组相比,43℃热疗后2h出现survivin蛋白的表达降低,其后survivin蛋白的表达反而上调（P<0.05）。43℃热疗后6h和24h Smac/DIABLO蛋白的表达明显增加（P<0.05）;而caspase-3蛋白表达增加出现在热疗后12-24h（P<0.05）。（2） 45℃热疗后各时间点HPV16E6 mRNA、survivin mRNA和蛋白的表达比对照组降低（P<0.05）。45℃热疗后12-24h Smac/DIABLO和caspase-3 mRNA的表达比对照组明显增加（P<0.05）。45℃热疗后6h Smac/DIABLO和caspase-3蛋白表达明显上调,并维持至热疗后24h（P<0.05）。（3） 47℃热疗后各时间点HPV16E6、Smac/DIABLO、survivin mRNA的表达均比对照组明显降低（P<0.05）;而caspase-3 mRNA在热疗后24h比对照组增加（P<0.05）。47℃热疗后2h Smac/DIABLO蛋白的表达和2-6hcaspase-3蛋白的表达比对照组明显增加（P<0.05）,之后两者的表达明显低于对照组（P<0.05）。47℃热疗后在各时间点survivin蛋白的表达显著降低甚至缺失（P<0.05）。（4） 43℃、45℃和47℃热疗后野生型p53 mRNA的表达比对照组明显减少（P<0.05）。（5）43℃和45℃热疗后24h caspase-3的AOD值比37℃和47℃明显增加（P<0.05）。而45℃和47℃热疗后caspase-3的核阳性指数增加,与37℃和43℃相比,差异具有显著性（P<0.05）。结论宫颈癌Caski细胞中Smac/DIABLO、survivn和caspase-3在mRNA和蛋白水平的表达变化与热疗温度和培养时间有关。45℃以上的热疗抑制HPV16E6 mRNA的表达。热疗后Smac/DIABLO通路诱导的Caski细胞凋亡可能不依赖于野生型p53基因的调控。热疗后caspase-3从细胞浆易位至细胞核是细胞凋亡的重要事件。第三章不同温度磁热疗对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的影响目的探讨不同温度磁热疗对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的作用。方法用人宫颈癌Hela细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,将Fe3O4磁性纳米颗粒直接注入肿瘤组织内,在交变磁场中进行磁感应加热治疗,分别控温在43℃和47℃持续30min,3天后重复加热一次,比较43℃组磁热疗组（43℃MFH）、47℃磁热疗组（47℃CMFH）、单纯磁流体组（MF组）、生理盐水（NS组）和对照组的肿瘤体积的大小、肿瘤体积抑制率、生存期和PCNA的阳性指数。结果热疗后的第1-4周47℃MFH组的肿瘤体积抑制率分别为47.05%、89.21%、88.55%、87.19%;43℃MFH组的分别为32.26%、52.64%、48.84%、38.42%。与对照组相比,43℃MFH组和47℃MFH组均能抑制肿瘤的生长（P<0.05）。与43℃MFH组比较,47℃MFH组抑瘤作用更显著,有33.33%的肿瘤消退率（P<0.05）。43℃MFH组和47℃MFH组的生存期分别为36.67±1.28d、49.33±3.19d,比对照组的27.33±1.41d明显延长（P<0.05）。而47℃MFH组与43℃MFH组的生存期之间的差异亦具有显著性（P<0.05）。PCNA的阳性指数在47℃MFH组显著降低为12.33±3.40%,与其它组相比,差异具有显著性（P<0.05）。结论43℃MFH组和47℃MFH组均能抑制人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的生长,延长裸鼠的生存期,抑制PCNA的增殖,但是以47℃MFH组的作用更为显著,甚至可以达到肿瘤完全消退的效应。