目的:胰腺癌作为消化系统肿瘤,恶性程度极高,发病率和病死率呈现出持续上升的趋势。组织学上,大约90%的胰腺癌为胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),起源于胰腺导管上皮。胰腺癌在发病早期缺乏典型的临床症状,极容易被误诊或漏诊,确诊时往往已经出现局部或远处转移,失去手术时机。这种肿瘤的中位生存率小于6个月,且预后极差。人星形胶质细胞升高基因1(astrocyte elevated gene 1,AEG-1)编码一个含有582个氨基酸的蛋白。AEG-1蛋白主要分布于细胞核周围和内质网区域,该蛋白含有一个跨膜通道和三个结构域负责富含赖氨酸的核定位信号。在人类的多种恶性肿瘤中,经常检测到有AEG-1升高,包括子宫内膜癌、肝细胞癌、胶质瘤等,并导致较差的临床预后。早期关于功能得、失的研究显示,在多种恶性肿瘤中,AEG-1的高表达与促进肿瘤生长、血管生成及肿瘤转移相关。但是在胰腺癌中的致癌机制仍然不清楚。虽然有研究表明在PDAC细胞系及胰腺癌组织中,AEG-1的mRNA和蛋白的表达均较高,但是其对AEG-1在胰腺癌致癌机制中的作用,并没有进行研究。临床上,在对于胰腺癌的治疗中,干扰细胞周期被证实是高度有效的。并且,在胰腺癌的治疗中,细胞周期抑制剂正在发展之中。体外实验中,在多种癌细胞中敲低AEG-1,通常促进细胞周期在G0/G1期停滞,但在不同的癌症细胞中,AEG-1的作用是不尽相同的。为了阐述AEG-1在胰腺癌细胞中调节细胞周期的作用,还需要进行更多的研究和努力。肿瘤的侵袭和转移需要降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM),在这个过程中,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)起到了关键的调节作用。有研究成果显示,AEG-1的高表达,通过增加MMP-2的转录活性,诱导骨肉瘤细胞迁移和侵袭。有研究显示,在PDAC组织中MMP-2呈高表达。我们将探寻AEG-1在PDAC细胞迁移和侵袭过程中的角色,并将研究焦点集中在对MMPs的研究上。在本研究中,一个特有的短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)被用于瞄准AEG-1基因的mRNA。在两组PDAC细胞系中,通过抑制AEG-1基因的mRNA表达,来评估正常PDAC细胞和AEG-1沉默的PDAC细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期分布及其凋亡。研究方法:构建AEG-1沉默的胰腺癌细胞,qRT-PCR及Western blot检测Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、β-catenin、p-β-catenin、cleaved caspase 3、p-AKT S473、AKT和β-actin的表达水平。细胞增殖实验评估AsPC-1、shAEG-1-NC、shAEG-1,PANC-1、shAEG-1-NC、shAEG-1各组细胞增殖能力,微球体培养实验观察AsPC-1、shAEG-1-NC、shAEG-1,PANC-1、shAEG-1-NC、shAEG-1各组细胞成球情况,流式细胞术用于检测评估细胞周期及细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,异种移植肿瘤模型检测肿瘤组织的凋亡情况。结果:1.构建AEG-1低表达的稳定转染细胞。我们发现在AsPC-1和PANC-1细胞中,AEG-1表达水平明显升高。因此,选择这两组细胞进行下一步研究。应用具有AEG-1特异性shAEG-1或shAEG-1-NC进行转染两种PDAC细胞,使用qRT-PCR和western blot检测AsPC-1和PANC-1中AEG-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果显示,与shAEG-1-NC组相比,转染了AEG-1特异性shRNA的AsPC-1和PANC-1两种胰腺癌细胞,AEG-1 mRNA和蛋白质表达水平下调了约70%,说明转染细胞构建成功。2.在体外实验,AEG-1沉默抑制PDAC细胞的增殖。采用CCK-8法检测体外培养的PDAC细胞中,AEG-1沉默对PDAC细胞生长的影响。持续稳定的AEG-1低表达,抑制两种PDAC细胞的增殖。集落形成实验进一步证实,敲低AEG-1后,可以显著的降低AsPC-1和PANC-1细胞的集落形成能力。两种AEG-1沉默的PDAC细胞集落形成率低于空白对照组。此外,我们利用细胞微球体培养实验检测了两种细胞系的细胞干性。细胞转染AEG-1 shRNA后,肿瘤细胞球的大小和数目均受到抑制。此外,通过对细胞周期的分析,我们发现,在两种PDAC细胞系中,AEG-1沉默可以诱导PDAC细胞的细胞周期停滞于G0/G1期。3.AEG-1沉默促进PDAC细胞凋亡。流式细胞术检测到AEG-1 shRNA转染后的PDAC细胞的凋亡均呈现显著增加。western blot检测促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2。与转染了NC shRNA的PDAC细胞相比,在转染了AEG-1 shRNA的PDAC细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下调,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表达水平上调。4.AEG-1沉默抑制PDAC细胞的迁移和侵袭能力。在AEG-1沉默的AsPC-1和PANC-1细胞中,划痕愈合能力显著减缓。AEG-1沉默的AsPC-1和PANC-1细胞迁移能力明显受到抑制。Transwell小室实验的结果显示AEG-1沉默的PDAC细胞其侵袭的细胞数量显著减少。此外,Western blot实验结果显示,在AsPC-1和PANC-1两种AEG-1沉默的PDAC细胞中,侵袭相关的蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平明显下降。5.AEG-1影响AKT/β-catenin信号通路。应用Western blot检测AKT、p-AKT、p-β-catenin以及核β-catenin的表达水平。当AEG-1沉默后,在AsPC-1和PANC-1细胞中,均检测到p-AKT表达水平下降,p-β-catenin的表达水平上调,但是当AEG-1沉默后,两种PDAC细胞中,细胞核内β-catenin的表达水平显著下降。6.AEG-1沉默抑制了异种移植肿瘤的生长。AEG-1-沉默的PDAC细胞的成瘤体积明显小于对照组。进一步检测获得的肿瘤内MMP-2及MMP-9的表达水平,转染了AEG-1 shRNA的两种PDAC细胞系中,MMP-2及MMP-9的表达水平也与AEG-1蛋白的表达水平一样显著下降。表明在移植瘤中AEG-1沉默可以导致细胞凋亡增加。结论:在PDAC细胞中较低的AEG-1表达显示出较弱的增殖、迁移和侵袭能力,同时细胞周期停滞于在G0/G1期。AEG-1沉默的PDAC细胞体外成瘤实验表现出,AEG-1沉默的胰腺癌细胞成瘤速度较慢。细胞周期进程的加速和失控是很多恶性肿瘤的标志。通过敲低AsPC-1和PANC-1两种PDAC细胞中内源性的AEG-1,我们发现AsPC-1和PANC-1两种PDAC细胞的细胞周期均停留在G0/G1期。虽然敲低AEG-1影响癌症细胞周期进程有过报道,但是我们的研究是首次将其作用在PDAC细胞中进行验证。逃避凋亡是肿瘤形成机制中的主要原因。有报道称,抗肿瘤药物可以介导AEG-1下调,microRNAs作用其靶mRNA或者小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),可以加速肿瘤细胞凋亡。我们观察到AEG-1 shRNA可以促进AsPC-1和PANC-1两种PDAC细胞凋亡。促凋亡和抗凋亡蛋白Bcl-2家族控制着线粒体外膜组件的透膜化作用。我们发现AEG-1沉默可以诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的下调和促凋亡蛋白Bax的上调,进而导致PDAC细胞凋亡加速。促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白Bcl-2家族成员之间的平衡,决定着细胞是否进入凋亡程序。我们除了分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白之外,同样观察到AEG-1与其他Bcl-2家族成员之间的相互作用。例如,在原始的人类胚胎星形胶质细胞中,AEG-1的高表达可以磷酸化细胞死亡的Bcl-2拮抗剂(Bcl-2 agonist of cell death,Bad)。Bad蛋白是一种唯BH-3域蛋白,被认为是凋亡的激活剂,它的磷酸化与癌细胞的存活有直接联系。Bad蛋白磷酸化导致其被14-3-3蛋白隔离,并向细胞基质移位。因为AEG-1高表达可以诱导Bad磷酸化,我们推测,AEG-1沉默可以促进Bad去磷酸化,导致PDAC细胞凋亡。另外,AEG-1的下调,可通过Bax/bcl-2通路影响肿瘤细胞的化学敏感性。除了AEG-1以外,还有Bax/bcl-2通路,也有报道通过促进细胞自噬作用抑制肿瘤细胞的化学敏感性,或者直接通过上调多重耐药基因(multidrug resistance gene 1,MDR1)、转录因子LSF和胸腺嘧啶合成酶(thymidylate synthase,TS)。在不久的将来,我们将致力于进一步研究AEG-1在肿瘤细胞凋亡中的作用机制。作为锌肽内切酶,MMPs可以切断几乎细胞外基质(extracellular matrix,ECM)内的所有成分。在胰腺癌中,MMPs可以由肿瘤或者间质细胞产生,它们的高表达与肿瘤的迁移和侵袭速度的增加相关。一些此前的研究已经将AEG-1上调MMPs诱导癌症细胞的迁移、侵袭联系起来,例如MMP-2,MMP-9,MMP-7等。我们也同样注意到,在PDAC细胞中如果AEG-1处于沉默状态,肿瘤细胞的迁移速率下降与MMP-2、MMP-9的下调同时出现。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是MMPs的生物调节者。他们的N-端结构域被认为是抑制性的结构域,负责对MMPs的抑制作用。MMPs介导的细胞外基质退化,与AEG-1介导的癌细胞迁移和侵袭相关,但是AEG-1是否影响TIMPs还不清楚,这还需要进一步的研究。AEG-1的高表达可以激活负责癌细胞存活、转移和抗药性的相关通路,例如NF-κB、Akt及Wnt/β-catenin信号通路。在细胞层面干扰上面所提到的通路,有可能发现潜在的限制PDAC细胞生长和转移的方法。研究发现,消耗AEG-1可以消除Akt的活性并且可以抑制Bcl-2蛋白的表达,FGF18随着Akt/GSK3β/β-catenin信号通路的激活,一起上调MMP-2和MMP-9。AKT是多种信号转导通路的关键中枢效应蛋白。磷酸化的AKT激活其下游分子,并与肿瘤的侵袭、转移、增殖和凋亡有着密切的相关。β-catenin可以与多种蛋白质相互反应,如钙粘蛋白(E-cadherin)、淋巴增强因子(LEF1)和转录因子4(TCF4),参与Wnt信号通路、细胞间粘附、肿瘤细胞转移和其他过程。AKT的活化促使癌细胞中β-catenin浓度升高,细胞核内β-catenin增加,从而加速肿瘤细胞的增殖。此外,还有其他研究称,AEG-1沉默可抑制PI3K/AKT通路,增加肿瘤细胞的凋亡。为了进一步探寻AEG-1抑制胰腺癌细胞增殖的分子学机制,我们检测了AKT/β-catenin信号通路相关的蛋白质。结果表明,在AsPC-1和PANC-1细胞中,当AEG-1沉默时,p-AKT蛋白水平降低,p-β-catenin水平上调,但肿瘤细胞的细胞核内β-catenin水平显著下调。与MMP-2一致,当AEG-1沉默时,PDAC细胞中MMP-9的表达也降低。因此,敲低AEG-1可影响MMP-2、MMP-9的表达水平,影响Bcl-2,并通过抑制AKT/β-catenin通路进一步抑制肿瘤细胞迁移。在目前工作的基础上,我们还将进行下一步的实验来研究AEG-1在胰腺癌发生通路中的作用。综上所述,我们的研究表明,在体外下调AEG-1可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。AEG-1沉默后,肿瘤细胞的细胞周期将停滞于G0/G1期。这些结果提示胰腺癌细胞需要AEG-1来维持其存活、转移、侵袭,提示AEG-1是未来胰腺癌治疗的潜在靶点。