羊草是禾本科赖草属的一种植物,属于多年生禾草,是草原上关键的牧草之一,产量高、草质好、适口性佳,在我国的牧草作物和生态草领域具有很高价值。最近几年,全球气候均有较大波动,使得不良环境条件尤其是干旱对我国草原地区产生了很大影响,大幅度降低了羊草的生产力,从而降低了牧民的经济收入,阻碍了畜牧业的发展。1.本研究根据课题组前期转录组实验筛选到的表达序列标签,通过BLAST比对分析得出:该基因编码350个氨基酸,并通过蛋白质保守结构在线网站分析得出:其编码C2H2型锌指蛋白,并含有WRKY结构域,其分子量大小为38.1kDa,将其命名为LcWRKY40。采用RT-PCR方法从羊草中克隆到该基因,经qRT-PCR表达特异性分析表明:LcWRKY40基因在羊草根、茎、叶、叶鞘、稃和花药中都有表达。同时,对生长两周的羊草幼苗施加PEG6000和碱性盐(NaHCO3)进而产生胁迫,发现LcWRKY40相对表达量在受到胁迫后上升,并且在叶和根中的表达相似,从而推测LcWRKY40蛋白可以对相应的逆境响应产生应答。2.将LcWRKY40基因构建到酵母表达载体上,再转入到酵母细胞中,检测到其受到碱性盐(NaHCO3)胁迫而表达量增加。3.为了检测其发挥功能的位置,使之融合到绿色荧光蛋白(GFP)中,检测该融合蛋白的表达,于细胞核中观察到了 GFP信号,说明LcWRKY40蛋白在细胞核中发挥功能。4.为了检测其蛋白的功能作用,运用EMSA试剂盒检测LcWRKY40-GST融合蛋白与生物素标记探针的凝胶阻滞信号,结果显示存在LcWRKY40-GST融合蛋白与生物素标记探针的特异结合条带,表明表达的LcWRKY40蛋白具有结合特异探针的作用。5.LcWRKY40转化本氏烟草,过表达LcWRKY40的烟草转基因植株干旱胁迫处理后,结果表明过表达植株均具有较强的耐旱性;并且在鲜重、丙二醛含量等生理指标上表现出过表达LcWRKY40植株优于野生型植株的情况;本研究又发现了过表达LcWRKY40基因的烟草和野生型烟草在表型上有明显差异,包括在叶片形态、叶边缘、表皮毛、叶绿素含量等方面有明显的不同。6.通过LcWRKY40转化水稻,获得了超表达转基因水稻。初步推断出LcWRKY40基因可以响应干旱逆境胁迫并参与调控,并且能够参与植物的生长和发育过程,可能在转录调控中直接或间接地发挥着重要的作用。综上所述,本研究揭示了 LcWRKY40转录因子能够参与干旱胁迫应答调节,对增强作物耐旱性起着重要作用,并且可能调控植物的表型和生长发育。