论文部分内容阅读
目的:氧化应激被认为是导致脑老化,进而影响认知功能降低的主要原因。虾青素（Astaxanthin,AST）及Sirt1/PGC-1α通路具有较强的抗氧化作用,对ROS有高效的清除能力,因此,本课题的研究目的是探讨虾青素能否通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导小鼠认知功能的改善,能否实现其对海马结构神经元的保护作用。本研究结果对于证明虾青素对海马结构氧化应激的调节机制具有重要的科学意义,并将为脑老化和老年性痴呆的预防和治疗以及虾青素的进一步开发和临床应用奠定可靠的理论基础。研究方法:1.动物模型制作及分组:采用6周龄的ICR小鼠,共60只,随机分四组进行饲养,即空白对照组（15只）,Aβ组（15只）,Aβ+AST组（15只）,Aβ+AST+NAM组（15只）。Aβ组是通过右侧侧脑室连续7天注射Aβ25-35（10μM,5μl/次）建立老化小鼠模型。Aβ+AST组为AST（10μM,10 mg/kg/d）连续灌胃30天饲养。Aβ+AST+NAM组为在Aβ+AST组灌胃的基础上连续腹腔注射7天烟酰胺（NAM,500μM,500mg/kg/d）。2.采用Morris水迷宫行为学测试,观察各组小鼠的空间学习记忆能力。3.采用免疫荧光染色方法观察各组小鼠海马结构三个亚区（CA1、CA3、DG）BDNF、SYN蛋白表达水平的变化情况;观察各组小鼠海马结构三个亚区Sirt1/PGC-1α通路蛋白Sirt1、PGC-1α表达水平变化情况;观察各组小鼠海马结构三个亚区Bcl-2、Bax表达水平变化情况。4.采用Western blotting方法检测各组小鼠海马结构BDNF、SYN蛋白表达水平变化情况;检测各组小鼠海马结构Sirt1/PGC-1α通路蛋白Sirt1、PGC-1α表达水平变化情况;检测各组小鼠海马结构Bcl-2、Bax表达水平变化情况。5.采用RT-PCR方法检测各组小鼠海马结构BDNF mRNA、SYN mRNA表达;检测各组小鼠海马结构Sirt1/PGC-1α通路蛋白Sirt1 mRNA、PGC-1αmRNA表达;检测各组小鼠海马结构Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达情况。6.检测各组小鼠海马结构ROS、SOD、MDA及GSH-px含量的变化;检测各组PC12细胞ROS、SOD、MDA含量的变化。7.采用CCK8法、Annexin-V/PI双染法及衰老相关β–gal染色方法检测各组PC12细胞凋亡及衰老情况。8.统计学分析方法:实验数据均以均数±标准差来进行表示。采用Graph Pad Prism5.0进行统计学分析。两组间比较用Tukey检验统计,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.Morris水迷宫行为学测试结果显示,经侧脑室连续多次注射Aβ25-35,能够引起小鼠学习记忆能力降低,体外补充虾青素能够使小鼠学习记忆能力提升,并且,虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路能够改善Aβ25-35介导小鼠的认知功能。2.免疫荧光染色结果发现,虾青素能够上调小鼠海马结构通路蛋白Sirt1及PGC-1α的表达,并且虾青素能够通过Sirt1/PGC-1α通路上调小鼠海马结构SYN、BDNF及Bcl-2的表达,下调Bax的表达。3.Western blotting结果证实,给予虾青素后,小鼠海马结构Sirt1、PGC-1α、SYN、BDNF及Bcl-2的表达水平增高,而Bax的表达水平降低。4.Real Time PCR结果证实,小鼠海马结构Sirt1 mRNA、PGC-1αmRNA、SYN mRNA、BDNF mRNA及Bcl-2 mRNA的表达水平在给予虾青素后增高,Bax mRNA的表达水平降低;RT-PCR结构与Western blotting结果中蛋白表达趋势较为一致。5.氧化应激相关指标检测结果显示,虾青素能够使老化模型小鼠海马结构ROS、MDA含量减低,SOD、GSH-px含量增高;并且虾青素能够使Aβ组PC12细胞内ROS、MDA含量降低,而SOD含量升高。6.CCK8法及Annexin-V/PI双染法检测结果证实,随着Aβ25-35浓度增加,PC12细胞的生存活性降低;虾青素能够降低PC12细胞凋亡率。7.β-半乳糖苷酶染色结果证明,Aβ25-35使阳性染色PC12细胞数量增高,虾青素能够使阳性染色细胞数量降低。结论:1.本研究证明了虾青素能够上调小鼠海马结构BDNF、SYN、Sirt1及PGC-1α表达的作用,通过Sirt1/PGC-1α通路能够改善对Aβ25-35介导的小鼠认知功能障碍。2.本研究结果证实了虾青素具有上调Bcl-2表达、下调Bax表达的作用,通过Sirt1/PGC-1α通路进一步发挥由Aβ25-35介导的小鼠海马结构神经元凋亡的保护作用。3.本研究结果表明了虾青素能够增强PC12细胞的活性,并通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导的PC12细胞衰老及凋亡具有保护作用。