论文部分内容阅读
目的:丹参饮为临床上治疗心血管疾病经典方,前期研究发现丹参饮提取物可通过PI3K-Akt信号通路改善心肌缺血造成的细胞损伤。本文以药动学研究为出发点,筛选大鼠口服丹参饮提取物后可吸收入血的有效成分,建立稳定可靠的血浆样品含量测定方法,研究有效成分的药动学特征及胃肠稳定性,并开展丹参饮提取物单次及多次给药在心肌缺血模型状态下的药效学研究,以期为进一步阐明丹参饮治疗心肌缺血的药效物质基础、剂型创新以及指导临床合理用药提供理论依据。方法:1.丹参饮经大鼠口服后入血成分鉴定结合实验室前期丹参饮指纹图谱研究和文献基础研究,对丹参饮化学成分进行筛选,并通过比对复方中主要成分对照品、含药血浆及丹参饮提取物甲醇溶液的一级质谱和二级质谱图,筛选出可入血有效成分,并作为丹参饮药动学研究的主要检测指标。2.丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B和丹参素在血浆中LC-MS含量测定方法的建立Porshell 120 EC-C18(4.6×50mm,2.7micron,Agilent)为固定相,采用APCI离子源和正离子多反应检测模式,以甲醇(A)-0.1%甲酸(B)为流动相,梯度洗脱,测定丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量;采用ESI离子源和负离子多反应检测模式,以乙腈(A)-0.1%甲酸(B)为流动相,梯度洗脱,测定丹酚酸B和丹参素的含量,建立四种成分在血浆中的含量测定方法,并进行方法学考察。3.丹参饮提取物在正常及心肌缺血模型大鼠体内的药动学研究将SD大鼠随机分为单次给药正常组、多次给药正常组、单次给药模型组及多次给药模型组,于给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼底静脉丛取血,LC/MS测定丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B、丹参素血药浓度,PK solver 2.0软件计算药动学参数,并用SPSS 20.0软件对正常组和心肌缺血模型组主要药动学参数进行方差分析。4.丹参饮提取物单次给药及多次给药后的药效学研究将SD大鼠随机分为空白组、模型组、单次给药模型组和多次给药模型组,分别在末次给药前及给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h眼底静脉丛取血,测定SOD活力和MDA的含量,分析其药效指数的变化趋势。5.丹参饮中有效成分在胃肠仿生环境中稳定性考察采用实验室前期建立的高效液相含量测定方法,考察丹参饮提取物中有效成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参素、丹酚酸B在胃肠仿生环境中稳定性。结果:1.丹参饮经大鼠口服后入血成分鉴定分析对照品、含药血浆及丹参饮提取物甲醇溶液的三重四级杆液质联用仪一级质谱扫描图和二级质谱扫描图,结果表明大鼠灌胃丹参饮提取物后可吸收入血的有效成分有丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B和丹参素。2.丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B和丹参素在血浆中LC-MS含量测定方法的建立成功建立了丹参饮中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B和丹参素在血浆中LC-MS含量测定方法,样本在13 min内即可完成分析,时间短,样品处理过程简便,方法学考察结果符合生物样品的定量分析要求。3.丹参饮提取物在正常及心肌缺血模型大鼠的药动学研究研究结果显示,无论是单次给药还是多次给药,模型组与正常组中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B、丹参素四种成分的药动学行为,均具有一定的差异性。药动学结果表明单次给药正常组中四种成分的生物利用度较低,药物总体吸收效果较差,多次给药可以增加有效成分在体内的蓄积量。多次给药模型组中,药物在体内的吸收效果好,四种有效成分生物利用度较高,体内的停留时间增长,并出现多峰吸收的现象。提示在心肌缺血的状态下,多次给予丹参饮后,可以迅速提高有效成分的血药浓度,缩短到达治疗浓度的时间,并出现药物蓄积的情况,从而维持较长时间的药效。4.丹参饮提取物单次给药及多次给药后的药效学研究药效学研究结果表明,与模型组相比,丹参饮提取物可提高血清中SOD活力,降低MDA含量,具有一定的抗氧化应激作用。在心肌缺血状态下,单次给药后药效与体内的血药浓度表现出一定的滞后现象,多次给药后,可以迅速达到药效指数的峰值。提示丹参饮多次给药后的药效优于单次给药,药效成分可以更快的到达效应部位,发挥药效。5.丹参饮中有效成分在胃肠仿生环境中稳定性考察研究结果表明,在仿生胃液环境中37±0.5℃水浴6 h后,丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参素含量无明显变化,丹酚酸B剩余83.61%;在仿生肠液的环境下37±0.5℃水浴12 h后,丹酚酸B、丹参素在肠液中含量无明显变化,丹参酮ⅡA、隐丹参酮分别剩余53.99%和58.37%,说明丹参饮水溶性成分丹酚酸B、丹参素在仿生胃肠环境下较稳定,而脂溶性成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮在仿生胃肠环境下则容易分解转化。结论:丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹酚酸B和丹参素为丹参饮可入血的有效成分,可能是其抗心肌缺血的药效物质基础。血浆中四种成分的LC/MS含量测定方法,可为丹参饮药动学研究提供技术手段。模型组和正常组大鼠血浆中四种有效成分的药动学行为具有差异性,心肌缺血状态下,药物的吸收效果较好,且多次给药可以增加有效成分在体内的蓄积量,这与中医“辨证施治”的理念一致。丹参饮具有一定的抗心肌缺血作用,给药后6 h内能维持较高药效指数。单次给药后,药效存在一定的滞后效应,而多次给药可以缩短药物的起效时间,维持较长时间的药效,本研究可为丹参饮的剂型开发和有效性评价提供药动学依据。