胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,根据其恶性程度分为Ⅰ、II级（低度恶性）、III级（退行性变）和IV级（具有星形细胞瘤表型或多型性胶质母细胞瘤）。化疗是治疗原发性中枢神经系统肿瘤的重要手段,与神经显微手术、放疗共同组成临床脑瘤的三联疗法,但脑瘤尤其是恶性程度高的胶质瘤的不均质性和对传统化疗药物的不敏感性严重阻碍了临床治疗疗效,常不能有效增加脑瘤患者的生存率,因此针对胶质瘤的不均质性设计新的化疗方案,开发更有效的化疗药物,增加肿瘤对药物的敏感度具有重要的临床意义。在胶质瘤的发生发展过程中,复杂的基因突变如癌基因过度表达,抑癌基因突变、缺失或功能性失活等构成胶质瘤不均质性的内源性基础,导致细胞逃逸内源性信号和环境因素严格调控的正常细胞增殖调控机制,最终发生癌变。生长抑制基因家族（the inhibitor of growth （ING） gene family）是近年发现的新的抑癌家族,包括ING1、ING2、ING3、ING4和ING5,具有多种肿瘤抑制功能,与p53关系密切。最早通过正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞系对比消减杂交PCR和衰老细胞文库克隆筛选首先发现了二型抑癌基因ING家族中的ING1（后称ING1b）,有不同的剪切异变体,在多种肿瘤和肿瘤细胞中以p53依赖方式参与细胞凋亡和细胞周期调控,具有抑癌基因特性和功能。与ING1相似,ING2能够通过p53依赖方式诱导细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,从而抑制细胞增殖;ING3能够激活p53转活化的启动子,包括p21和Bax的启动子,引起S期细胞减少并诱导细胞凋亡;在RKO细胞中瞬时高表达ING5可引起S期细胞减少并诱导细胞凋亡,其作用具有p53依赖性并伴有p21表达上调。新近研究发现,最初从人垂体组织中分离的ING1同源基因ING4（GenBank Accession Nos. AF110645或NM₀16162）能够与p300相互作用促使p53乙酰化;通过与NF-kB亚单位p65（RelA）结合参与调控脑瘤的生长和血管生成;诱导HepG2细胞发生G2/M期周期阻滞,抑制细胞生长,并增加细胞对某些DNA损伤药物的敏感性。虽然ING4被列为抑癌基因候选分子,但其在胶质瘤发生发展中的具体功能以及作为基因治疗靶分子的潜在价值尚需进一步研究。有报道提示ING4表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关,低表达ING4的脑瘤细胞U87MG在裸鼠中的成瘤性和肿瘤血管生成程度明显高于ING4高表达的胶质瘤细胞,可能参与调控胶质瘤细胞生长和肿瘤血管生成。目前ING4作用的分子机制尚不清楚,有限的研究报道指出可能与p53功能密切相关;可与NF-kB亚单位p65 （RelA）相互作用,转录抑制NF-kB-反应基因表达;在Gene H. Barnett2 & Rakesh K. Jain等的研究中还发现ING4反义核酸能够明显上调COX-2的表达,提示ING4可能与COX-2密切相关。深入揭示ING4在胶质瘤发病机制中的重要作用,研究其在胶质瘤细胞中的功能和分子机制将为今后进一步研发其作为胶质瘤抑癌基因用于基因治疗的潜在可行性奠定重要的理论基础。多酚植物提取物Curcumin （diferuloylmethane）,又称姜黄素,多年临床和实验研究表明其是重要的肿瘤预防药物,既为阻断剂,通过中和致癌物质或预防致癌物质激活而阻断肿瘤启动,又为抑制剂,抑制肿瘤发生发展过程中细胞增殖,从而抑制、延迟或逆转多种肿瘤的发生。此外近来研究提示curcumin还具有潜在的肿瘤治疗作用,能够抑制星形细胞细胞中AP-1的DNA结合和转录活性,从而抑制MMP-1, -3, -9的基因表达,体外实验进一步证实其能有效抑制胶质瘤细胞侵入,提示可能作为肿瘤临床化疗方案的候选药物,在胶质瘤的治疗中具有重要的临床价值。分子机制研究发现curcumin能够下调转录因子NF-kB, AP-1和Egr-1,抑制细胞粘附分子、趋化因子、TNF、MMP-9和COX-2表达,发挥肿瘤抑制、抗氧化和抗炎作用。由于curcumin能够抑制多种肿瘤的发生、发展和转移,并且作为食物和传统中药中的自然提取物,具有可靠的药物安全性,因此成为肿瘤预防和治疗中极具前景的药物。目的:检测不同恶性程度的胶质瘤组织和正常脑组织中ING4的表达,深入探讨ING4与胶质瘤发生发展、恶性程度和预后的相关性,以及参与胶质瘤发生的作用机制;观察curcumin对胶质瘤细胞体外生长增殖的抑制作用,剂量-效应关系,以及低剂量curcumin对细胞周期的影响,探讨其分子机制和II型抑癌基因ING4的潜在功能;观察高剂量curcumin诱导胶质瘤细胞凋亡作用,揭示凋亡信号途径,探讨curcumin在胶质瘤中的肿瘤治疗作用,为进一步的临床可行性研究奠定基础。方法:第一部分（1）免疫组化ABC方法检测正常脑组织和恶性程度不同的胶质瘤组织中ING4的表达及分布。（2） Western blot分析ING4在正常脑组织和胶质瘤组织中蛋白表达。（3）细胞免疫荧光染色检测ING4在胶质瘤细胞系U251和SGH44细胞中的表达和分布。第二部分（1）利用MTT检测curcumin对胶质瘤细胞体外生长增殖的影响。（2） RT–PCR检测ING4 mRNA在胶质瘤细胞U251和SGH44细胞中的表达。（3） FACS观察低剂量curcumin对胶质瘤细胞周期分布的影响。（4） DNA ladder电泳检测低剂量curcumin诱导的胶质瘤细胞凋亡。（5） Western blot检测curcumin诱导胶质瘤细胞周期阻滞过程中p53、p21^waf1/cip1、CyclinB1、Cdc2和ING4蛋白表达变化。（6）细胞免疫荧光染色检测curcumin作用胶质瘤细胞后ING在胶质瘤细胞中的表达和分布。第三部分（1）利用MTT检测curcumin对胶质瘤细胞体外生长增殖的影响。（2） FACS观察高剂量curcumin对胶质瘤细胞周期分布的影响。（3）透射电镜观察细胞凋亡。（4） DNA ladder电泳和FACS检测高剂量curcumin诱导的胶质瘤细胞凋亡。（5） Western blot分析高剂量curcumin诱导胶质瘤细胞凋亡中p53、p21^waf1/cip1、Bcl-2家族分子、ING4、caspase-3和PARP蛋白表达变化。（6）免疫检测细胞色素C释放。结果:第一部分（1） ING4在正常脑组织强阳性表达或中度阳性表达。（2）星形细胞瘤标本中可见ING4呈弱阳性表达或不表达,ING4的阳性表达率在Ⅰ级和Ⅱ级无显著差异,Ⅲ级和Ⅳ级显著降低,表达强度和表达范围随肿瘤恶性程度增加有降低趋势。（3） Western blot分析胶质瘤组织中ING4蛋白的表达水平,结果显示在胶质瘤组织中ING4蛋白不表达或呈低表达。（4）细胞免疫荧光检测ING4在胶质瘤细胞U251和SGH44中的分布表达,结果显示在两株细胞中均检测不到ING4表达。第二部分（1） RT-PCR分析2株胶质瘤细胞U251和SHG44中ING4 mRNA的表达水平,结果显示ING4 mRNA在U251细胞中几乎检测不到,而在SHG44中有低水平的表达,按mRNA表达水平高低排序正常脑组织>SHG44>U251。（2） Western blot分析胶质瘤细胞U251中ING4蛋白的表达水平,结果显示在U251细胞中几乎检测不到ING4蛋白表达。（3） MTT检测细胞生长和增殖,结果显示curcumin能够显著抑制胶质瘤细胞U251的生长,抑制作用具有量效依赖关系。（4） FACS检测细胞周期分布改变,结果显示低剂量curcumin能够引起U251细胞发生显著的S期和G2/M期细胞周期阻滞,并有剂量依赖关系,但在10μM剂量下细胞未发生显著凋亡。（5） DNA电泳结果显示10μM的curcumin作用U251细胞24小时后没有形成明显的DNA ladder。（6） Western blot结果显示低剂量curcumin上调p53和p21^waf1/cip1的蛋白表达,下调Cyclin B1和Cdc2蛋白表达,并且诱导ING4蛋白表达。（7）细胞免疫荧光检测curcumin作用下胶质瘤细胞中ING4蛋白表达的改变,结果显示10μM的curcumin作用24小时后细胞核中检测到ING4蛋白表达。第三部分（1） MTT检测细胞生长和增殖,结果显示25μM的curcumin处理细胞24小时后细胞存活率为41.2±5.39%,48小时后细胞存活率为33.5±8.37%,72小时后细胞存活率为21.4±7.35%,与阴性对照相比,24小时或更长时间细胞生长抑制有统计学意义。（2） FACS检测高剂量curcumin对细胞周期分布的影响,结果显示U251细胞G0/G1期细胞增加,出现了显著的凋亡峰。（3）透射电镜观察细胞凋亡结果显示高剂量curcumin作用U251细胞发生凋亡细胞增多,出现典型的超微结构特征。（4）DNA电泳结果显示高剂量curcumin作用U251细胞24小时后形成明显的DNA ladder,提示curcumin诱导U251细胞凋亡。（5） FACS检测高剂量curcumin诱导胶质瘤细胞凋亡,结果显示curcumin未处理的U251细胞主要分布在B3区域,即90%以上的细胞为活细胞,几乎没有细胞发生凋亡;25μM的curcumin处理24h后细胞分布向B2和B4区域扩散,说明发生明显的细胞凋亡,并不导致细胞大量坏死。（6） Western blot检测结果显示高剂量curcumin作用后U251细胞中p53和p21^waf1/cip1表达显著上调;不诱导ING4蛋白表达;抗凋亡因子Bcl-2的表达显著下调,而促凋亡分子Bax和Bak的表达水平没有明显改变,Bcl-2: Bax的比例下降。（7）免疫检测胶质瘤细胞凋亡过程中细胞浆的细胞色素C水平改变,结果显示高剂量curcumin作用后U251细胞中细胞浆的细胞色素C水平增加。（8） Western blot结果显示高剂量curcumin作用后检测到活性caspase-3亚单位p17,并且特异性裂解底物PARP（p116）成p85亚单位。结论:本研究证实ING4在正常脑组织强阳性表达或中度阳性表达,在胶质瘤组织中呈弱阳性表达或不表达,表达水平随肿瘤恶性程度增加而降低,在胶质瘤细胞U251和SGH44中不表达。Curcumin能够以时间-剂量依赖方式有效抑制胶质瘤细胞体外生长,低于IC50的药物剂量下影响细胞周期分布,诱导S期和G2/M期细胞周期阻滞,高剂量的curcumin诱导了G0/G1期细胞阻滞和显著的细胞凋亡。不同剂量的curcumin在胶质瘤细胞中激活不同的信号转导途径,诱导细胞发生不同的细胞行为学改变,其中决定细胞周期阻滞和凋亡不同信号通路的的关键环节还需进一步研究。低剂量curcumin诱导G2/M期周期阻滞过程中ING4的表达上调,在高剂量curcumin诱导的细胞凋亡过程中并没有检测到预期的ING4表达上调,提示ING4可能不参与curcumin诱导胶质瘤细胞凋亡途径。本研究进一步分析curcumin诱导胶质瘤细胞发生G2/M期周期阻滞的分子机制,发现低剂量的curcumin显著上调p53和p21^waf1/cip1蛋白表达,下调CyclinB1和Cdc2蛋白表达,推测curcumin通过p53依赖方式诱导细胞周期阻滞,p53和其下游分子p21^waf1/cip1表达上调抑制了CyclinB1和Cdc2的表达水平,从而引起细胞发生G2/M期阻滞。深入研究高剂量curcumin诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制发现,curcumin显著上调p53和p21^waf1/cip1蛋白表达,下调抗凋亡因子Bcl-2的表达,而促凋亡分子Bax和Bak的表达水平没有明显改变,Bcl-2: Bax的比例下降,细胞色素C从线粒体中释放增加,caspase-3激活,裂解特异性底物PARP（p116）成p85亚单位,提示curcumin以p53依赖方式发挥作用,影响Bcl-2凋亡家族蛋白表达,降低线粒体膜稳定性,最终激活caspase-3,诱导细胞凋亡。阐明curcumin在胶质瘤细胞中的功能和机制不仅为其临床应用奠定基础,也为发展更为有效的肿瘤预防或治疗药物提供新的潜在靶分子。