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目的:实验运用改良的四血管阻断法制备全脑缺血再灌注的Wistar大鼠模型,全脑缺血前经由侧脑室注射m TOR(mammalian target of rapamycin)抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RPM)抑制其活性,并联合使用鼻咽腔降温法对头部进行浅低温处理,处理完成后观察再灌注时期大鼠脑内P70s6K、p-P70S6K(磷酸化的P70s6K)的表达以及海马CA1区m TOR、p-m TOR(磷酸化的m TOR)的表达。研究浅低温在头部的实施以及抑制m TOR通路的活性联合浅低温在头部的实施对大鼠大脑缺血后再灌注损伤的影响,由此进一步探讨在头部实施浅低温对该损伤可能产生影响的机制,为临床上预防或治疗脑部缺血后再灌注损伤性疾病提供新的理论依据。方法:1实验分组体重250~300g的健康雄性清结级Wistar大鼠60只(由河北医科大学实验动物中心供应)。将大鼠根据实验研究需要随机分为5组(n=12):假手术组(S组)、全脑缺血/再灌注组(I组)、低温组(T组)、低温+Rapamycin组(R组)、低温+DMSO组(D组)。2全脑缺血再灌注模型制备本实验运用改良的Pulsinelli四血管阻断法制备大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠常规禁食8小时,无需禁水,称重后进行麻醉,以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射。麻醉完成后将动物固定在动物实验台上,俯卧位进行剪毛、消毒,在颈后正中第一、二颈椎处切开皮肤并进行组织分离,使双侧翼小孔暴露。使用自制实验器材的尖端深入双侧小孔中烧灼其下走行的两侧椎动脉造成闭塞,缝合皮肤并消毒。24 h后以同样方法再次麻醉大鼠,麻醉成功后仰卧固定于实验台上,气管插管维持自主呼吸,吸入氧气以及间断给予七氟醚维持麻醉。开放尾静脉通路以1ml/h速度持续泵入乳酸钠林格氏液以保证大鼠机体循环需要。颈前正中剪毛消毒切开皮肤,分离双侧颈总动脉,用4-0丝线分别穿过双侧颈总动脉备用。3实验处理与监测室温维持在23~25℃,用小热水袋放置于大鼠躯干下并联合调整60瓦白炽灯高度保证大鼠直肠温度始终维持在(37.0±0.5)℃。大鼠全脑缺血时间为15 min,再灌注2 h。各实验分组进行不同处理干预:S组即假手术组暴露双侧翼小孔,分离双侧颈总动脉,但不烧灼椎动脉使其闭塞,也不夹闭双侧颈总动脉。剩余四组均烧灼双侧椎动脉并夹闭双侧颈总动脉,造成全脑缺血。其中,T、R、D组为低温组,均实施低温处理:在全脑缺血前对大鼠进行气管插管,在咽喉部气管插管旁放置棉球及吸痰管以防止误吸,经双侧鼻腔置入20G硅胶管,深度约为20 mm,以100 ml·min-1·kg-1速度持续泵入4-5℃0.9%氯化钠溶液对头部实施浅低温处理,低温过程中使用吸引器持续吸引防止误吸。等到海马温度降至(33.0±0.5)℃后,将双侧颈总动脉结扎15 min,低温维持1 h后保持自然复温。R、D组为给药组,在全脑缺血前1h利用大鼠脑立体定位仪为R组经左侧脑室缓慢注射Rapamycin 5μl(10mmol/l),D组左侧脑室注射等容量的DMSO。实验全程监测大鼠脑电图(头皮刺入电极)、心电图(四肢皮下刺入电极)、海马温度(温度探头置入右侧海马CA1区即前囟后3.6 mm、中线右旁开3 mm和皮层下2 mm)以及直肠温度。4标本采集及检测4.1免疫组织化学法测定脑组织中P70S6K蛋白及p-P70S6K蛋白的表达及苏木精-伊红(HE)染色后光镜检测假手术组观察2h,剩余四组再灌注2 h后,每组随机取6只大鼠进行麻醉(10%水合氯醛腹腔注射)麻醉成功后,用4%多聚甲醛迅速经心灌流固定,固定后快速断头取脑并将脑组织放入4%多聚甲醛溶液中继续固定,在4℃冰箱中保存,标本用于免疫组织化学检测。4.2海马Western Blot方法检测m TOR、p-m TOR蛋白表达取每组另外6只大鼠,以10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉完成后,快速断头打开颅骨取出大脑,在冰盘上谨慎分离出海马组织,快速放入冷冻管暂时保存在于液氮中,之后移入-80℃的冰箱中保存准备用于Western Blot方法检测m TOR、p-m TOR蛋白表达。结果:1五组大鼠的体重比较的差异无统计学意义(P>0.05)2 HE染色后光镜观察病理结果S组:位于海马CA1区的神经元形态与结构均正常。细胞胞浆丰富呈粉红色,细胞核大而圆呈蓝色,核仁明显,细胞整体呈圆形和椭圆形并且边界清晰。细胞排列整齐且分布均匀,未见异常细胞。I组:海马CA1区正常神经元形态和结构严重损伤,正常细胞显著减少,可见胞体皱缩,胞浆肿胀。细胞形状不规则,排列紊乱且分布不均。存活细胞显著减少。T组:与I组相比,海马CA1区神经元形态和结构的损伤程度明显减轻。有少量细胞胞体皱缩,细胞排列稍显紊乱,层次增多,存活细胞数目明显增多。R组:与T组相比,海马CA1区神经元形态和结构损伤较重,胞体皱缩变小,细胞核固缩深染,细胞形状不规则,细胞排列不规整,存活细胞数目减少。D组:与R相比,海马CA1区神经元形态和结构损伤程度较轻,细胞排列比较整齐,存活细胞数目明显增多,与T组相比,海马CA1区神经元形态和结构损伤无显著差异。3脑组织中P70S6K蛋白及p-P70S6K蛋白的比较与S组比较,I组、T组、R组和D组p-P70S6K表达均增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。与I组比较,T组、R组和D组p-P70S6K蛋白表达均增多,差异有统计学意义(P<0.05)。与T组比较,R组p-P70S6K蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与D组比较,R组海马组织中p-P70S6K蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。各组P70S6K蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)。其余组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4大脑海马CA1区m TOR蛋白及p-m TOR蛋白表达的比较与S组比较,I组、T组、R组和D组p-m TOR蛋白表达均增多,差异均有统计学意义(P<0.05);与I组比较,T组、R组和D组p-m TOR蛋白表达均增多,差异有统计学意义(P<0.05);与T组比较,R组p-m TOR蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与D组比较,R组p-m TOR蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。各组m TOR蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。其余组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:头部浅低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤具有比较明显的逆转作用,并且具有神经保护作用,其作用机制与m TOR通路活性的激活有关。