二穗短柄草BdSnRK2.6和BdSnRK2.7基因的克隆、表达分析及遗传转化

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植物作为生态系统中的主要成员,在生长过程中总会受到一些恶劣环境的影响,例如低温、干旱以及高盐等。然而植物在长期的进化过程中通常会产生一些抗逆机制,以适应不良环境。  在动植物体内有许多与抗逆胁迫有关的机制,其中由蛋白激酶所催化的蛋白质的磷酸化与去磷酸化是普遍存在一种调节机制,参与生物体中多种信号途径的转导。蔗糖非酵解相关蛋白激酶2是蛋白激酶中的一种。它是广泛存在于植物体内的一类Ser/Thr蛋白激酶,有研究证实其能够提高非生物逆境的耐受性以及参与多种信号途径的转导。水稻以及拟南芥等植物中都发现大量的此激酶的存在,而新型单子叶模式植物二穗短柄草,还未见SnRK2基因研究的报道。本实验成功克隆二穗短柄草BdSn RK2.6和BdSn RK2.7两个基因,利用分子生物学及遗传学等方法研究了这两个基因在抗逆方面的作用,得到的主要研究结果如下:  (1)通过同源比对短柄草基因组数据库得到了BdSn RK2s序列,以此序列来设计特异引物,克隆得到两个SnRK2基因的全长cDNA序列,依据系统进化树分别命名为BdSnRK2.6和BdSnRK2.7。  (2)利用荧光定量PCR技术检测基因在二穗短柄草不同器官中的表达情况,结果显示,BdSn RK2.6在茎以及叶中有表达,在根和穗中未检测到表达;BdSn RK2.7在根、茎、穗中均有表达,但在叶中未检测到表达。通过模拟非生物逆境胁迫及信号分子处理二穗短柄草,发现这两个基因对多种处理都显示表达量上调。  (3)构建成功酵母表达载体pYES2-BdSnRK2.6和pYES2-BdSnRK2.7酵母表达载体,将重组质粒以及空载体质粒转化到酵母INVSC1中,对转基因酵母进行不同胁迫处理,发现转BdSnRK2.6基因酵母在50℃处理下表现出一定的抗性,而转BdSnRK2.7基因酵母在高盐处理下表现出一定的抗性。  (4)构建成功pCAMBIA1304-BdSnRK2.6和pCAMBIA1304-BdSnRK2.7植物表达载体,基因枪法转化洋葱表皮细胞实验显示,BdSnRK2.6和BdSnRK2.7亚细胞定位无特异性,分布在整个细胞中。  (5)将重组载体质粒以及空载体质粒通过农杆菌转化导入烟草中,得到转基因阳性植株。  本实验研究结果为进一步研究BdSnRK2.6和BdSnRK2.7在响应非生物逆境胁迫中的作用以及为对该基因家族的功能研究打下了基础。
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