转化医学(Translational Medicine)是21世纪国际医学科学领域的崭新概念,是一种打破单一地追求基础研究成果或临床疗效的僵局,致力于使基础研究与临床应用通力合作,以患者为中心,提高整体医疗水平的新概念。随着我国老龄化社会的到来,转化医学理念在老年医学的教育和临床工作中必将发挥更大的作用。细胞是生命体结构形成和功能实现的承担者。当细胞外的信号通过细胞膜传递至细胞内时,细胞会依据所接收的信号激发一系列生物化学反应,完成某种信号通路的转导。Notch信号通路表达广泛,属于在进化上高度保守的单次跨膜受体蛋白,主要通过介导细胞之间的信息传递而参与调控细胞生物发育,继而引起一系列生物学行为。Notch信号活化最早由临近细胞表面的Notch配体和受体接触开始,当Notch蛋白经历三次剪切后,胞内片段NICD被释放入核,并与信号通路最关键分子—转录因子RBP-J结合而募集转录共激活复合物,启动下游基因的表达。大量研究证明,Notch信号在细胞、组织、器官的分化、发育过程中起着重要的调控作用。人类多种疾病,如遗传病、肿瘤、老年病等的产生都与Notch通路组成分子的突变和表达异常密切相关,而转录因子RBP-J是介导Notch信号的关键转录因子。因而我们设想,靶向RBP-J介导的Notch通路的转录调控一定会在疾病的治疗和转归过程中产生积极的指导作用。国外研究发现:Notch信号通路的关键转录分子RBP-J可与LIM结构域蛋白Kyo T2(人FHL1C在小鼠中的同源物)结合而募集多种转录共抑制分子,从而抑制RBP-J介导的Notch信号下游基因的转录,抑制Notch信号的活化。课题组前期的研究揭示:FHL1C/Kyo T2发挥转录抑制是通过与RING1和HPC2相互作用,并与RBP-J形成复合物而实现的。然而,FHL1C/Kyo T2分子缺少核定位相关信号,其入核调控各类分子的机制很有可能是通过其它间接方式完成,如:改变修饰方式,或者通过与其他核蛋白的相互作用实现。课题组前期为揭示FHL1C入核介导转录抑制的机制,利用蛋白质谱分析发现:FHL1C可能与鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基中的GNB2蛋白相互作用。进一步证实FHL1C与GNB2之间存在相互作用以及揭示其作用机制将有助于深入了解FHL1C对Notch信号抑制的分子机制。巨噬细胞是机体内重要的吞噬和抗原提呈细胞,巨噬细胞不同的极化分型与老年病、代谢性疾病、肿瘤等多系统、多脏器疾病存在相关性,而极化状态的失衡是引起一系列疾病发生的关键。因此,合理干预巨噬细胞极化的相关步骤,扭转表型失衡状态,避免免疫相关性疾病的发生和指导治疗具有实际的临床应用价值。文献和课题组前期在实体瘤中研究证明,Notch信号与巨噬细胞极化存在及其紧密的关系:Notch信号激活可促进巨噬细胞向M1型极化,发挥促炎、抗肿瘤的作用;剔除Notch信号关键分子RBP-J,促使巨噬细胞向M2型极化,发挥抗炎、促肿瘤的作用。但Notch信号调控巨噬细胞极化的详细分子机制尚不清楚。因而,为了进一步揭示Notch信号调控巨噬细胞极化的分子机制,我们在小鼠骨髓来源原代巨噬细胞中观察了Notch信号转录抑制物Kyo T2通过调控Notch活性而对巨噬细胞极化的影响,为靶向Notch信号调控巨噬细胞极化治疗相关疾病奠定理论基础。为了更全面的阐明Notch信号抑制物FHL1C/Kyo T2的生物功能,我们利用免疫共沉淀和哺乳动物双杂交技术,从分子、细胞水平验证FHL1C与其候选相互作用分子GNB2的关系,进而丰富FHL1C调控Notch信号通路的分子机制。为了观察LIM结构域蛋白Kyo T2能否通过Notch调控巨噬细胞极化,我们利用分子生物学方法和技术,观察沉默Kyo T2后Notch信号通路及巨噬细胞极化状态的改变,以期进一步完善Notch信号调控巨噬细胞极化的作用和机制,为将来靶向干预Notch信号通路及巨噬细胞免疫应答提供新思路和新策略。本课题分两部分完成,具体如下:1、LIM结构域蛋白FHL1C与GNB2相互作用验证1)通过分子克隆技术成功构建GNB2的真核表达载体p CMV-VP16-GNB2和p CMV-Flag-GNB2,转化扩增新构建载体及实验室保存的FHL1C的真核表达载体p CMV-GAL4-DBD-FHL1C和p CMV-myc-FHL1C。酶切结果符合相对应条带大小,DNA测序正确。2)利用瞬时转染及双荧光素酶报告基因检测方法进行哺乳动物双杂交实验,结果提示相对于阳性对照组,FHL1C和GNB2实验组不能激活下游报告基因Luciferase的表达,FHL1C和GNB2间不具有物理相互作用。3)免疫共沉淀实验检测细胞裂解液中FHL1C与GNB2是否形成共沉淀复合物。Western blot结果显示:实验组中GNB2与FHL1C未形成共沉淀复合物,提示FHL1C和GNB2不存在生理上相互作用。2、LIM结构域蛋白Kyo T2通过Notch信号调控巨噬细胞极化的初步研究1)诱导分化骨髓单核细胞6天,通过流式细胞术鉴定CD11b/F4/80双阳性巨噬细胞数量,确定骨髓单核细胞诱导分化成巨噬细胞的效率。采用LPS+IFN-γ诱导M1型巨噬细胞、IL-4诱导M2型巨噬细胞,通过q RT-PCR检测巨噬细胞极化标志物的表达(P<0.01),确定巨噬细胞极化诱导成功。2)通过PCR技术检测不同极化状态下小鼠巨噬细胞中Kyo T2的表达。采用si RNA技术沉默巨噬细胞中Kyo T2基因的同时,巨噬细胞中Notch信号下游基因Hes1、Hey1表达被激活(P<0.05),Notch信号活化。3)沉默巨噬细胞不同表型中Kyo T2表达后,与对照组相比,巨噬细胞M1型标志性分子表达无显著改变,M2型标志性分子表达降低(P<0.05)。提示:Kyo T2促进巨噬细胞向M2型极化。综上所述,本课题丰富了LIM蛋白FHL1C/Kyo T2抑制Notch信号及调控巨噬细胞极化的分子机制。主要研究结论为:1、LIM结构域蛋白FHL1C与GNB2之间未发现明显的物理和生理上相互作用。质谱分析的FHL1C与其他候选分子的相互作用的研究仍需要继续进行,以期全面揭示FHL1C/Kyo T2入核抑制Notch信号的机制和生理意义。2、LIM结构域蛋白Kyo T2可通过Notch信号调控巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,与课题组前期剔除Notch信号或用GSI阻断Notch信号促进巨噬细胞向M2型极化相一致。结合课题组前期工作,提示Kyo T2可以作为Notch信号的抑制物及调控巨噬细胞极化的候选分子进行临床前研究。