论文部分内容阅读
本实验通过离体培养和温室盆播的方式获得了大量尤力克柠檬的小种子苗，再通过RAPD技术、染色体根尖压片技术、形态观察等手段，对这些小种子苗的遗传多样性进行了较深入的研究，结果表明：1．小种子的界定及其出现频率本实验对156个成熟尤力克柠檬中的大、小种子出现情况做了统计，结果表明：饱满小种子的平均粒重只有0.034克，约为普通种子粒重的1／4。根据已有的文献资料和实际的操作，我们把重量只有或不及普通种子粒重1／3的种子称为小种子，其中包括能达到要求的瘪粒小种子。在出现频率上，平均每个果实中有0.865颗饱满小种子和1.359颗瘪粒小种子存在。饱满小种出现频率为3.5％，瘪粒小种子出现频率为5.6％，总的小种子出现频率为9.1％。2．离体培养（1）最佳接种培养基为不附加任何其它物质的MS基本培养基，萌发率可达90.0％，成苗率可达85.0％。（2）最佳增殖培养基为MS+0.5mg／L6-BA+0.5mg／LKT+0.1mg／LNAA，平均增殖倍数可达4.4。（3）最佳生根培养基为1／2MS+1.0mg╱LNAA+0.5mg／LIBA，平均每芽生根数可达8.14条。3．RAPD鉴定（1）本实验采用改良CTAB法提取DNA，结果表明：幼嫩的组培苗叶片提取效果相当好，不易褐化，得到的DNA量大，产率达到198-372ng／mg鲜叶；质量好，A260／A280的比值为1.71-1.92，无需去除RNA就能用于RAPD分析，符合RAPD反应的要求。（2）对反应体系的优化结果表明，最佳的反应体系为：反应总体积25μl，其中引物浓度1.5μmol／L，Mg2+的浓度为2.5 mmol／L；dNTP的浓度为150μmol／L；Taq酶的浓度为1.4U；Buffer25mmol／L；DNA模板浓度为40 ng。加去离子水补充总体积至25μl。（3）反应程序：93℃预变性2min，93℃变性1min，36℃复性1min，72℃延伸2min，42次循环。最后一次72℃延伸10min，4℃保存。（4）从74个随机引物中筛选出12个条带数量多且清晰、多态性好的随机引物用于本实验的扩增。总共得到2032条清晰谱带，其中特异性谱带347条，占总条带数的17.8％。随机选取的11株小种子苗均表现出遗传上的差异，而普通种子苗却与之相反，没有一株表现出差异。4．形态鉴定形态鉴定的结果表明，与普通种子苗相比，小种子苗在形态上表现出差异，叶片偏圆、偏厚，叶色更浓绿，叶形指数（长／宽的比值）变小。小种子苗的平均长／宽值为1.53，而普通种子苗的平均长／宽值为2.22，在p=0.01水平差异显著。5．染色体计数本实验对随机选择的14株组培小种子苗进行了根尖染色体压片分析，结果发现，14株小种子苗中有5株小苗的染色体数目为27条，而普通的柠檬二倍体植株染色体条数为18条，表明这5株幼苗是三倍体植株，三倍体出现频率达到35.7％。