【摘 要】
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第一部分 不同激活剂对PRP分泌的外泌体质量和数量的研究目的:选择最佳的PRP激活剂,以获得高质量的外泌体用于下一步的研究方法:（1）使用不同的激活剂（葡萄糖酸钙,凝血酶或两者共同）激活PRP后,收集PRG,进行HE染色观察纤维蛋白分布,上清通过梯度超速离心法获得外泌体。（2）通过TEM,Nanoflow和Western blot比较和分析不同组间外泌体的数量,质量,体积大小和生长因子含量方面的差
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第一部分 不同激活剂对PRP分泌的外泌体质量和数量的研究目的:选择最佳的PRP激活剂,以获得高质量的外泌体用于下一步的研究方法:（1）使用不同的激活剂（葡萄糖酸钙,凝血酶或两者共同）激活PRP后,收集PRG,进行HE染色观察纤维蛋白分布,上清通过梯度超速离心法获得外泌体。（2）通过TEM,Nanoflow和Western blot比较和分析不同组间外泌体的数量,质量,体积大小和生长因子含量方面的差异。结果:（1）凝血酶激活PRP速度远远大于葡萄糖酸钙,联合使用凝血酶和葡萄糖酸钙效果优于单一使用激活剂;（2）通过TEM,Nanoflow,Western blot检测确定各组间沉淀物为外泌体;（3）TEM,Nanoflow,Western blot结果表明葡萄糖酸钙和凝血酶混合液可以激活PRP释放最高浓度的外泌体,且外泌体所含生长因子（VEGF,PDGFBB,b FGF,TGF-β）浓度最高。结论:葡萄糖酸钙和凝血酶混合液优于单一激活剂,可以激活PRP释放高浓度和高质量的外泌体。第二部分 血小板来源外泌体对2型糖尿病鼠创面的治疗和机制的研究目的:我们前期研究证实PRP中含有大量生长因子,可促进糖尿病足患者创面愈合,但其机制尚不清楚。研究表明,激活后的血小板会释放大量的外泌体。外泌体在细胞间通信中发挥着重要作用,具有良好的应用前景。本研究旨在研究血小板来源的外泌体对2型糖尿病鼠创面的影响和机制的探究。方法:1.外泌体的分离和鉴定:使用梯度超离心法从PRP中分离外泌体。采用TEM、Nanoflow和WB鉴定外泌体。2.动物实验:采用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠建立全层皮肤创伤模型。将大鼠随机分为对照组和PRP-Exos组,每组10只。PRP-Exos分散注射于创面边缘,对照组注射等量的PBS。观察并评价PRP-Exos对炎症反应和创面愈合的影响。通过HE染色、免疫荧光和免疫组化对组织进行组织学分析。3.细胞学实验:采用HUVECs、HDF进行细胞学分析。通过免疫荧光、CCK8、transwell、tube formation、Western blot分析细胞外泌体摄取、细胞迁移、细胞增殖,并利用信号通路抑制剂来进一步验证外泌体对细胞信号通路的影响。结果:动物实验结果显示,与对照组相比,PRP-Exos能显著促进皮肤创面愈合（p<0.05）。HE染色、Masson染色、免疫组化、免疫荧光结果显示,与对照组相比,PRP-Exos促进了创面愈合,增加了胶原沉积,改善了创面基质构成,同时新生了较多的皮肤附属物,有助于无瘢痕创面的形成。细胞学实验表明,PRP-Exos可刺激HDF和HUVEC的增殖和迁移,且呈剂量依赖性,最佳剂量为50ug/ml。此外,与空白对照组和抑制剂组相比,PRP-Exos处理组显著激活Akt信号通路,促进HDFⅠ型胶原、Ⅲ型胶原生成、抑制α-SMA蛋白的表达（p<0.05）。结论:我们的实验结果表明,血小板源性外泌体可能通过激活Akt信号通路促进糖尿病鼠创面的愈合,同时改善创面重塑,为未来治疗糖尿病创面提供了新的方法。
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